川芎嗪促进脑缺血耐受形成的作用及机制研究

胡永红，周爱民，田 野，朱钰宝

(石家庄市中医院河北医科大学，河北石家庄 050051)

本实验观察川芎嗪干预脑预缺血(CIP)的效果及其促进脑缺血耐受的形成，并初步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

健康昆明小鼠96只，雌雄不拘，体重30g～40g，河北医科大学实验中心提供，在实验室常规饲养2d后用于实验。盐酸川芎嗪注射液购自石家庄乐仁堂药店;10%水合氯醛由天津市化学试剂厂生产;多聚甲醛为张家口市化工试剂厂生产;Bax兔多克隆抗体、Bcl-2鼠单克隆抗体、生物素标记二抗由北京中山生物公司生产;NO试剂盒、NOS试剂盒为南京建成生物公司;TGL-16G-A型低温高速离心机由上海安亭科学仪器厂生产;DK-600A型电热水浴恒温箱由上海一恒科技公司生产;光学显微镜为重庆光电仪器公司生产;病理图像采集系统为日本olympus。

1.2 方法

将96只健康昆明小鼠随机分为假手术组、缺血损伤组、BIT模型组、TMP干预BIT组4组，每组24只。TMP干预组用川芎嗪按40mg/kg/d腹腔注射，连续3d;假手术组、缺血损伤组腹腔注射等量生理盐水。第1次腹腔注射30min后所有小鼠经10%水合氯醛0.33ml/100g腹腔麻醉，仰卧固定于手术台上，颈前正中开口，钝性分离双侧颈总动脉。BIT模型组、TMP干预BIT组用微动脉夹夹闭双侧颈总动脉6 min作为预处理，然后恢复灌流。假手术组、缺血损伤组只暴露双侧颈总动脉6 min，不阻断血流。最后1次腹腔注射30min后，所有小鼠经乙醚吸入麻醉，暴露双侧颈总动脉，缺血损伤组、BIT模型组、TMP干预BIT模型组均阻断血流40 min，然后恢复灌流;假手术组只暴露颈总动脉40min，不阻断血流;术中及术后注意保暖，正常饮食。术后24h从各组随机选取12只小鼠断头处死，迅速剥取全脑，左侧半球低温保存，采用生化方法检测脑组织NOS活性和NO含量;右侧半球用4%多聚甲醛溶液固定，常规石蜡切片，采用免疫组化方法检测海马组织Bax和bcl-2蛋白表达。其余小鼠于术后7d全部处死，迅速剥取全脑，冠状切取视交叉后1mm～4mm脑片，多聚甲醛固定，常规石蜡切片，HE染色，光镜下观察海马CA1区组织学分级和神经元密度(neuronal density，ND)。

1.3 检测指标

1.3.1 参照 Kitagawa和 Kato[1]分级方法，对海马CA1区域组织学改变进行分级(0级:无神经元死亡;1级:散在的神经元死亡;2级:成片的神经元死亡;3级:几乎全部的神经元死亡)。

海马CA1区神经元密度在高倍镜下记数双侧海马CA1区每1mm区段未死亡的锥体细胞数目，每侧记数3个区段，取其平均数为神经元密度(neuronal density，ND)。

1.3.2 小鼠脑组织NO和NOS含量测定 用预冷的生理盐水制备10%脑组织匀浆，3500r/min离心10min，取上清液，采用分光光度法测定组织中NOS活性，按每毫克组织蛋白每分钟生成1nmol NO为1个酶活力单位。采用硝酸还原酶法检测组织中NO2－/NO3－含量(μmol/gprot)间接反映 NO 含量。

1.3.3 Bax及bcl-2蛋白表达测定 通过观察海马CA1区bcl-2、Bax阳性细胞数占片中神经元总数的百分比分级情况来反映bcl-2、Bax蛋白表达情况。bcl-2、Bax阳性细胞是指胞浆及胞膜内侧出现棕黄色颗粒的海马神经元。±为阳性细胞数20%，+为阳性细胞数20% ～50%，++为阳性细胞数50%～75%，+++为阳性细胞数>75%。每只小鼠随机取1张切片，阳性细胞数分级越高，反映bcl-2、Bax蛋白表达越强。

1.4 数据处理

2 结果

2.1 术后7d海马CA1区组织病理学改变

图1显示，假手术组海马CA1区无明显组织学损伤，锥体细胞排列整齐致密，形态完整，胞核饱满，核仁清晰，组织学分级多为0级和1级。图2显示，缺血损伤组海马CA1区组织学损伤明显，主要表现为锥体细胞缺失较多，残留的锥体细胞排列松散不规则，多数锥体细胞胞核固缩，组织学分级多为2级和3级，与假手术组相比有显著性差异(P<0.01)。图3显示，BIT模型组海马CA1区组织学损伤较亦明显，组织学分级多为2级和3级，与缺血损伤组相比无差异(P>0.05)。图4、表1显示，TMP干预BIT模型组海马CA1区组织学损伤较缺血损伤组和BIT模型组明显减轻，锥体细胞排列较整齐，胞核饱满，核仁较清晰，有散在的锥体细胞缺失或胞核固缩，组织学分级多为1级和2级(P<0.05)，但仍明显低于假手术组(P<0.01)。

图1 假手术组海马CA1区组织学表现(HE染色×400)

图2 缺血损伤组组海马CA1区组织学表现(HE染色×400)

图3 脑预缺血组海马CA1区组织学表现(HE染色×400)

图4 川芎嗪干预组海马CA1区组织学表现(HE染色×400)

表1 术后7d海马CA1区组织学分级资料

表2 脑缺血术后7d海马CA1区神经元密度

表2显示，与假手术组相比，缺血损伤组、BIT模型组、TMP干预BIT模型组海马CA1区神经元密度明显降低(P<0.01)。缺血损伤组、BIT模型组之间无显著性差异(P>0.05)，TMP干预BIT组神经元密度明显高于BIT模型组和缺血损伤组(P<0.01)。

2.2 术后24h脑组织NOS活性和NO含量变化

表3显示，与假手术组相比，缺血损伤组、BIT模型组、TMP干预BIT组小鼠脑组织中NOS活性和NO含量明显升高(P<0.01)，缺血损伤组、BIT模型组之间无显著性差异(P>0.05)，TMP干预BIT模型组NOS活性及NO含量较缺血损伤组、BIT模型组明显降低(P<0.01)。

表3 术后24h脑组织NOS活性和NO含量变化(s)

表3 术后24h脑组织NOS活性和NO含量变化(s)

注:*P<0.01 vs假手术组;△△P<0.01 vs BIT模型组;△P>0.05，☆P<0.01 vs缺血损伤组

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2.3 术后24h海马CA1区Bax和bcl-2蛋白表达

表4、5显示，假手术组Bax可见微弱表达，bcl-2未见明显表达。与假手术组相比，缺血损伤组、BIT模型组、TMP干预BIT模型组Bax、bcl-2表达明显增多(P<0.01)，而缺血损伤组、BIT模型组之间无统计学意义(P>0.05)。TMP干预BIT模型组与缺血损伤组比较，Bax表达明显减少(P<0.05)，bcl-2表达明显增多(P<0.01)。与BIT模型组相比，Bax表达明显减少，bcl-2表达明显增多(P<0.05)。

表4 术后24h海马CA1区bcl-2蛋白表达

表5 术后24h海马CA1区Bax蛋白表达

3 讨论

预处理现象(ischemic preconditioning，IP)最早是由Murry等于1986年在犬心肌缺血模型中发现的，继后大量研究进一步肯定了心肌缺血预处理的保护作用，且已有临床应用报道。自从1990年脑缺血预处理诱导脑缺血耐受被发现以来，这种激发自身机制对严重脑缺血产生保护作用的方法受到了人们的广泛关注[1]。通过对这种自发性保护机制的深入研究，发现其中有效的保护效应因子及剂量，最终应用于临床，将具有极大的应用前景。从某种意义上讲，轻微、短时的脑缺血不但对机体无害，反而具有一定的脑保护作用，使神经元对抗较重脑缺血的能力得以提高，这引起人们深思。为什么有短暂性脑缺血发作(transient ischemic attacks TIA)经历的病人，当其发生脑梗塞时，与无TIA发作者相比梗塞面积往往较小，病情也往往较轻，预后相对较好。这似乎进一步从临床角度部分验证了CIP的脑保护作用，然而仍然有相当一部分TIA病人会最终甚至很快发生脑缺血性卒中。这说明CIP的脑保护作用是有限的，仅靠临床病人被动TIA发作来增强脑组织抗缺血缺氧能力是很不充分的，况且TIA本身就预示着较严重脑缺血发生的可能性大大增加。因此，采用有效手段来干预CIP，进一步加强其神经保护作用，这对于作为缺血性脑卒中高危人群的TIA患者来讲，可能是更为积极、有效的预防和治疗措施。

川芎(ligustrazine)是临床上常用的1味活血化瘀药，为伞行科藁木属植物的根茎，枯草杆菌的代谢产物，性辛温，归肝胆心包经，具有活血行气、祛风止痛功能，为血中气药。现代药理学研究表明，川芎的主要成分含有生物碱、阿魏酸等酚性物质，又含有挥发油内酯类以及维生素A、甾醇、叶酸等。大量临床观察证明[2～5]，川芎具有清除自由基、抗脂质氧化作用、抑制缺血组织细胞凋亡、抑制钙超载等作用，在治疗缺血性脑血管病及其后遗症上均有较好疗效，而且无明显毒副作用。而氧化应激和细胞凋亡是脑缺血后神经元损伤的重要机制，Bax和bcl-2是细胞凋亡的重要调节基因，NO及NOS也在其中起着重要作用。

bcl-2是一种抗凋亡基因，其广泛存在于上皮细胞、造血细胞、淋巴细胞、神经细胞及多种瘤细胞中。实验表明，缺血预处理后，侧脑室持续输注 bcl-2反义寡聚脱氧核苷酸72h后再次给予60min的缺血，bcl-2的表达减少并阻断缺血预处理后脑缺血耐受的形成，说明bcl-2在脑缺血耐受的形成中起着重要作用[6]。大量动物实验证明，bcl-2表达上调是预缺血处理产生脑保护作用的机制之一。Bax是一种促凋亡基因，Bax缺乏鼠脑缺血缺氧后海马区受损的细胞明显减少。细胞受刺激后是否存活取决于bcl-2/Bax表达比率，比值越高，细胞存活率越高;比值越低，细胞凋亡率越高。Brambrink等给大鼠腹腔注射3-NPA(一种线粒体毒素)预处理后，使用实时反转录聚合酶链反应技术定量分析结合免疫组织化学分析，转录水平和翻译水平的 bcl-2/Bax比率均升高。由此可见，Bax基因家族可通过其成员间的相互作用对细胞的存活和凋亡进行调节，并参与脑缺血耐受的形成。

近些年来，对NO及NOS在脑预缺血中的作用越来越受到人们的重视。如观察缺氧预处理的离体大鼠海马脑片的电活动，发现第2次缺氧复氧后诱发电位波幅得到明显恢复，NOS阻断剂7NI抑制脑片神经细胞电活动的恢复，提示cNOS产生的NO参与了缺氧预处理对神经元的保护作用。关于整体下NO是否参与BIT的诱导，导师周爱民的实验证明，整体水平下NO参与大鼠海马CA1区锥体细胞BIT的诱导过程，并发现CIP诱导BIT时，可使海马CA1区NOS表达增加，因此提出适量的NO增加，可能是CIP保护作用的机制之一。

本实验观察到，BIT模型组与缺血损伤组相比，bcl-2蛋白、Bax蛋白表达无明显变化，小鼠脑组织NO含量及NOS活性无显著变化，进一步证明了6min的预缺血处理的保护作用是有限的，它保护不了后续40min的严重缺血损伤。川芎嗪干预BIT模型组Bax蛋白表达明显低于BIT模型组，bcl-2蛋白表达明显高于BIT模型组，NO含量明显减低，NOS活性减弱。由此推测，川芎嗪可能与CIP有协同作用，进一步提高bcl-2/Bax比例，增强抗凋亡效应，减少自由基损伤，促进脑缺血耐受的形成。这可能是川芎嗪增强CIP脑保护作用的重要机制。

然而，CIP脑保护作用及其机制的研究刚刚起步，采用中医药手段干预CIP促进脑缺血耐受形成的报道更少，因此可供借鉴的经验极其有限。川芎嗪增强CIP脑保护作用的价值到底有多大?川芎嗪干预CIP增强脑缺血耐受是两者作用的简单相加，还是两者确实有协同效果，抑或是两者之间根本就不存在相互作用等诸多疑问，均有待进一步深入探讨。

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