多功能细胞传感器集成芯片的设计及实验研究

肖丽丹 余 辉 胡朝颖 蔡 华 刘清君 王 平

(浙江大学 生物传感器国家专业实验室，生物医学工程教育部重点实验室，生物医学工程系，杭州 310027)

引言

随着微加工工艺的发展，细胞传感器和芯片的结合已经越来越紧密，以细胞作为一级传感器，芯片二级传感，能检测外界环境变化对细胞的影响，因此可应用于细胞学研究、药物筛选、药效评估、环境监测、临床疾病诊断等多个领域。目前比较常用的细胞传感器主要有胞外电位检测类器件如微电极(microelectrode arrays，MEA)［1］和场效应管(field effect transistor，FET)［2］、阻抗传感器(electric cellsubstrate impedance sensing，ECIS)［3］、微 生 理计等［4］。

虽然这些细胞传感器已经有了广泛的应用，但是在细胞生理实验时，大多数都只能检测细胞某一方面的生理活动，而忽略或者无法同时检测细胞其他功能或结构的变化，减少了信息获取。因此，本实验室在累积了以前工作经验的基础上，设计了一种集成 ECIS、MEA、光寻址电位传感器(lightaddressable potentiometric sensor，LAPS)三种传感器的新型细胞多功能参数检测的集成芯片。此设计能同时对细胞生长状态及细胞胞外电场、离子代谢等功能等进行实时检测，也可选择性地对细胞某两方面的参数进行同步监测，并能对电兴奋和非电兴奋细胞都可研究，增加了实验的灵活性和应用的广泛性。

ECIS系统是检测细胞在电极表面的贴附、迁移等引起的细胞-电极贴附阻抗的变化，一般用交流阻抗谱来表征。叉指电极(interdigited electrodes，IDE)能对细胞群体的阻抗进行检测，因此本设计中ECIS功能模块电极采用了IDE，主要用于对在不同条件中细胞状态的实时监测。

MEA是制作在绝缘基底上，大小和细胞相匹配的金属薄片圆盘阵列，直径一般为几十微米，每个独立圆盘有独立引线引出和外界系统相连。当具有电兴奋性的细胞培养于其上时，能感应胞外动作电位的变化，并输出至外部系统以供分析。通常平面型MEA具有夹层结构，即导电的金属薄层置于两绝缘层间(底层为玻璃基底或生长了SiO2的硅基底，上层为氧化硅或氮化硅保护层)，同时和细胞接触用于传感的金属薄层位点暴露。

LAPS为一种光寻址细胞微生理计，当表面沉积不同的离子选择性膜时，可对相应离子的浓度进行检测，如H+，Na+，K+等。它的基本原理是半导体的内光电效应，即当半导体受到一定波长的光照射时，半导体吸收光子发生禁带到导带的跃迁，产生电子空穴对。给LAPS外加反向偏置电压时，半导体中产生耗尽层，这时靠近耗尽层的电子空穴对就被耗尽层拉开，当调制光强时 ，就会产生光生电压。此时，外界微小的偏压(如细胞表面微环境电压或离子流变化)就会产生一个微小的信号。

文中将对集成芯片的设计、加工流程及器件的性能进行分析讨论，并进一步讨论其潜在应用。

1 集成芯片设计及制作

1.1 集成芯片设计

整个集成芯片由三部分组成:叉指电极、微电极阵列、光寻址电位传感器。芯片各部分的布局如图1所示。整个芯片面积为17.7 mm×17.7 mm。各功能模块在集成芯片中呈对称分布，MEA为上下两组，LAPS分布于芯片四角，IDE则分布于芯片中心左右两组。芯片各模块共享参考电极，并将三部分在空间上进行接地隔离，同时用作LAPS区域标记。表1为各部分参数，其中MEA电极位点为圆形，直径为 25 μm，和通常心肌细胞大小 10～30 μm大小相匹配，相邻电极间距为200 μm，减小了相邻电极之间的电场干扰。LAPS的面积不能过小亦不能过大，这是由于LAPS部分需在背面湿法刻蚀减薄硅片，刻蚀有一定角度，因此设计面积过小会使刻蚀后区域不够;而减薄后面积太大则会使硅片易碎，给加工带来风险。在 IDE设计中，当电极宽度减小时，每根电极的阻抗就会增大，从而沿着单根电极会形成电势差，细胞贴附在不同位置对总阻抗的贡献会不同，这种情况是不希望出现的。因此电极宽度不宜过小，长度不宜过长，使灵敏度和有效细胞数目达到较好的平衡。

图1 集成芯片的设计图Fig.1 The layout of the integrated chip

1.2 集成芯片加工

在加工工艺中，MEA和IDE都采用金电极且基底结构和保护层结构均一样，因此可共享加工工艺。而LAPS无金电极且其各绝缘层厚度和MEA、IDE不一致，所以需要在加工中将两部分工艺融合。具体的加工工艺流程见图2。加工过程主要分成5个阶段，这些阶段中包括了图2所示的11个步骤。

表1 集成芯片各模块参数Tab.1 Parameters of the designed integrated chip

1)LAPS区域背面减薄。芯片以硅为基底，厚度为430 μm。在清洗以后首先硅片背面 LAPS对应区域减薄，刻蚀时用光刻胶将之外的区域用光刻胶作保护。背面减薄后可以减轻光强衰减对LAPS的影响。(步骤1和步骤2)

2)LAPS表面绝缘层生长及沉积。背面减薄后的硅片接着热生长一层50 nm的SiO2，并使用化学气相沉积(PECVD)工艺在其上面沉积一层100 nm的Si3N4。用光刻胶保护，将LAPS表面之外的区域SiO2和Si3N4刻蚀。(步骤3和步骤4)

3)保护 LAPS的同时加工 MEA及 IDE。为避免影响MEA和IDE部分加工对LAPS的影响，LAPS部分需被保护。在前几步加工的基础上，芯片上采用PECVD沉积一层厚度为600 nm的SiO2层，既用于硅片和金属层之间的绝缘，也用于对LAPS表面的保护。金属层采用Au/Ti复合层，Ti用于增强金和沉积了SiO2的硅基底之间的黏合度。接着用光刻胶保护，刻蚀出 MEA＆IDE的电极和引线图案。由于引线部分需要和外界绝缘隔离，因此800 nm厚的Si3N4沉积其上，并用光刻胶保护将电极电位和焊盘暴露。(步骤5～步骤9)

4)去保护露出 LAPS。在 Si3N4保护层刻蚀后并在光刻胶去除之前，将正面和背面用于保护LAPS部分的 SiO2层刻蚀，此时 MEA、IDE、LAPS三部分的基本工艺完成。(步骤10)

5)硅片背面LAPS区域处溅射 Al层。LAPS部分的信号在硅片背面输出，用光刻胶保护在减薄部分外的区域溅射铝层，用作欧姆接触。(步骤11)

图2 集成芯片加工工艺过程流程图Fig.2 The fabrication proceeds of the integrated chip

1.3 集成芯片封装

为将芯片检测到的信号输出至外部系统，芯片中MEA和IDE电极位点对应的裸露焊盘和PCB板上的对应焊盘用金线键合。而LAPS则通过芯片背面将信号输出，因此在PCB板和芯片接触处裸露出金盘，并用导电胶将芯片背面的镀铝层黏合来实现导电。在欧姆接触完成后，用环氧树脂将所有接触处封合，避免受到溶液干扰或腐蚀。芯片和PCB封合后，用一直径为2 cm的有机玻璃圆环并用环氧树脂将芯片封装，用作细胞培养腔。PCB板的信号则通过单排插针输出到外部系统的前置放大器处。图3为封装后的芯片实物图。

图3 封装后的芯片实物图Fig.3 The picture of the packaged device

1.4 集成芯片测试

在完成芯片设计、加工、封装后，对集成芯片各模块性能进行了测试、评估。

图4为集成芯片各模块的电学测试结果。在测试中，集成芯片腔体中注入pH为7.4的PBS溶液，并且放入有法拉第屏蔽箱的培养箱中检测，模拟细胞生长环境的同时也避免了外界电磁干扰。

由于IDE是阻抗传感器，采用交流阻抗谱进行了测试。图4(a)为IDE的交流阻抗谱测试结果。在频段103～104.5Hz内，阻抗幅度值成近似线性，相位近似为一恒定值，因此主要呈容性;在频率范围104.5～106Hz时，阻抗幅度值降低，相位值下降，此时阻抗谱变化由容性和阻性共同引起。因此频率范围104.5～106Hz更适宜检测细胞阻抗，且对细胞贴附过程的表征具有较好的灵敏度。

为保证MEA能检测细胞的胞外电位，各通道电极需具有较小的阻抗，从而减小因为阻抗引起的热噪声。通常，在频率1 KHz时阻抗值低于100 KΩz时，噪声值能较稳定。类似IDE的测试方法，微电极扫描得到的阻抗幅度如图4(b)所示。在1 KHz时，阻抗值为600 KΩ，引起的噪声幅度达20 μV以上，其基线漂移严重。为了能将噪声幅度减小，在工艺基础上，对微电极表面做了电镀铂黑处理，在电极表面附着上“棉絮”状的纳米级铂黑颗粒，使电极的比表面积增大，从而降低阻抗［5］。电镀后，在1 KHz时，阻抗降为7 KΩ，噪声基线幅度能减小至(14±2)μV，基线平稳，满足信号检测要求。

LAPS利用背面 LED照射，频率为6 KHz时偏压-光生电流曲线如图4(c)所示。线性区和饱和区明显，从图中可以看出，所制备的芯片的线性区范围大约为－600 mV～150 mV，线性度较高。

由于此集成芯片主要用于离体培养细胞的生理参数检测，因此芯片需和细胞之间具有生物相容性。为测试芯片的相容性，在芯片上培养了心肌细胞系HL-1。首先，将芯片在75%的酒精和去离子溶液中轮流冲洗，为保护芯片的结构，动作宜轻，直至在显微镜上观察芯片表面清洁为止。清洗后的芯片在高温消毒或紫外曝光后，表面涂布明胶，进行HL-1培养，具体培养方法可参考文献［6］。培养3 d后，细胞伸展贴附于芯片上，且出现了一致性搏动，证明了芯片具有良好的细胞相容性。

2 讨论

本研究中，为了能同步对细胞的生长状态、细胞生理功能(如电位、离子代谢)等进行同步检测，3种功能类型的器件 IDE、MEA、LAPS集成加工在同一硅基底芯片上，且保证了对同一批次培养的细胞进行不同角度的研究。

在设计中，保证了各部分功能的多通道检测;各功能模块对称分布，有利于减少芯片上细胞的分布不均性而带来的数据偏差;在加工时，由于模块之间的结构差异，因此采取了 LAPS-MEA＆IDELAPS的加工顺序，有机地将3种功能传感器加工在同一硅基底上;加工封装后的器件在测试结果中证明，其电学特性上满足了细胞各功能检测的指标，并实验证明了芯片具有良好的生物相容性。

因此本芯片可运用于细胞生理参数的实验，并能长期、无损地对细胞生理状态、功能进行实时跟进并综合分析。但是在实验过程中，三部分功能传感器之间的协调仍需进一步研究，并应根据所检测细胞对象不同、所设计实验的不同而进行适当改进，以获取最佳实验结果。

图4 各部分的性能测试结果。(a)IDE电极的交流阻抗谱;(b)MEA中微电极在电镀铂黑前后的阻抗变化;(c)LAPS的偏压-光生电流曲线Fig.4 The test results of the integrated chip.(a)impedance spectroscopy of the IDE;(b)the impedance of amicroelectrodein MEA beforeand afterthe electroplation ofplatinum black;(c)biasvoltagephotocurrent curve of LAPS

3 结论

由于集成芯片的功能全面性，在应用方面可对细胞基本的生理特性进行研究如细胞黏附、迁移过程中的功能性参数变化。可对非电兴奋性细胞的生长状态和离子代谢进行结合分析，亦可对电兴奋性细胞生长、迁移过程中状态变化和电生理活动之间的关系，和对细胞的生长过程进行定量分析。

在药物对细胞作用后，可对细胞在药物作用时候的状态迁移变化和功能缺失方面作同步研究。例如，当前心脏病依旧是威胁人类生命与健康的一大类疾病，研究各种心脏病类药物对心脏的作用，非心脏类药物对心脏的毒性是心脏药物筛选的两大课题。用集成芯片对心肌细胞进行监测时，动作电位幅度、频率、阻抗的幅值、相位，及胞外各种离子如H+，Na+，K+等浓度变化，有助于建立一个全面的评价系统，并可通过模式识别、主成分分析等方法对药物的药效或毒性进行定量分析。

另一方面，集成芯片也可用于对神经网络的研究。如神经毒素对神经网络传输、编码等的影响。如可用于对嗅觉、味觉细胞在不同气体或味道的刺激下，对其动作电位发放编码、胞外微环境离子代谢等进行同步检测，探索嗅觉、味觉系统的机理，进一步推动人工嗅觉、味觉系统的发展。

［1］Kovacs GTA.Electronic sensors with living cellular components［J］.Proceedings of the IEEE，2003，91(6):915－929.

［2］Ingebrandt S， Yeung Chi-kong， Krause M， et al.Cardiomyocyte-transistor-hybrids for sensor application ［J］，Biosens Bioelectron，2001，16(7－8):565－570.

［3］Keese CR and Giaever I.A Biosensor that Monitors Cell Morphology with Electrical Fields ［J］，IEEE Eng Med Biol，1994，13(3):402－408.

［4］余辉，蔡华，徐莹，等.基于多种敏感膜的多参数细胞微生理计研究［J］，微纳电子技术，2007，44(7－8):1671－4776.

［5］IlicB，CzaplewskiD，NeuzilP， etal. Preparation and Characterization of Platinum Black Electrodes［J］，J Mater Sci，2000，35(14):3447－3450.

［6］Claycomb WC，Lanson NA Jr，Stallworth BS，et al.HL-1 cells:a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95(6):2979－2984.