乳增宁膏对乳腺增生病模型大鼠内分泌激素及免疫功能的影响

曹 晖 刘丽芳* 祁 林

湖南中医药大学第一附属医院中医外科（410007）

乳腺增生症的发病原因尚不十分清楚。一般认为与卵巢内分泌功能紊乱有关。黄体素分泌不足，雌激素相对或绝对过多，以致月经周期中乳腺组织增生和复旧过程发生紊乱，使乳腺导管或腺泡上皮增生，乳管扩张成囊状，形成肿块。目前，西医常采用雌激素类药物及碘制剂等疗法，效果不甚理想且不良反应较大，外科手术治疗又常引起其他部位的复发，且患者较难接受。湖南中医药大学第一附属医院中医外科刘丽芳教授结合多年的临床经验，制成乳增宁膏治疗本病，临床疗效显著，本研究对乳增宁膏外治乳腺增生病进行了实验研究，观察其对乳腺增生大鼠内分泌激素及免疫调节相关物质的影响，以期探讨乳增宁膏治疗乳腺增生病的作用机制，为中医外治本病提供可靠的实验及理论依据，具体报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

一级SD雌性未孕大鼠，体治疗（226±16）g，实验动物由中南大学湘雅医学院动物实验中心提供，动物合格证号：湘医动字第20-011号。于SPF级动物实验室饲养，室温23～25℃，相对湿度40%～70%。

1.2 仪器与试药

日本产CL-7200自动生化分析仪，GL-1200Y放射免疫计数器，B超（日本ALORasso-620型），ACUSAN128XP/10彩超（USA产）。苯甲酸雌二醇、黄体酮（天津金耀氨基酸有限公司，批号分别为H20070536、H200705545）；乳增宁膏由湖南中医药大学第一附属医院药剂科制备，药物组成：九香虫、丁香、延胡索、皂角刺、王不留行、乳香、没药、海藻、昆布、鹿角胶、仙灵脾、橘核、白附子、木鳖子、麝香。药物制备：除麝香外所有药物研末，过100目筛，麝香另置，加入氮酮促皮吸收剂，搅匀制成膏料，加入载体聚脂，贴膏，再用层压的方法将膏药与保护层（聚乙烯薄膜）复合乳增宁膏剂备用。

1.3 动物造模及分组

参照文献[1]进行造模。对大鼠进行常规饲养，并每天肌内注射苯甲酸雌二醇0.5mg/kg，1次/d，连续20d，继而改用黄体酮5mg/kg，1次/d，连续5d。造模成功。

60只大鼠随机分为5组，正常对照组10只，乳腺增生模型组10只，乳增宁膏低、高剂量组各10只，乳癖消灌胃组10只，乳癖消外敷组10只。待造模成功后，乳增宁膏高、低剂量组每天进行乳增宁膏外贴，选取造模后大鼠最肿大的第二对乳房用药物外贴，每3d换药1次，连续60d。乳增宁膏低剂量组0.12g（6g/kg），高剂量组0.24g（12g/kg），覆盖面积均为3cm2。乳癖消外敷组：乳癖消片研磨成细粉0.8g/kg，方法与疗程同上。于实验第61天处死动物，取颈动脉血检测血清内分泌激素、T细胞等；取乳腺组织观察ER、PR；HE染色，光镜下观察导管上皮层数、小叶腺泡数目。

1.3 观察指标

①血清内分泌激素测定，放免法测血清中孕酮（P）、睾酮（T）、雌二醇（E2）、垂体促乳素（PRL）（测定试剂盒由北京华英生物技术研究所生产）。②用免疫组织化学法测定雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR），光镜观察导管上皮数，小叶腺泡数。③间接荧光免疫法测T细胞亚群CD3、CD4、CD8，计算CD4/CD8的比值的表达和变化。

1.4 统计学方法

所有数据输入SPSS13.0软件中，采用方差分析，各组间比较用q检验，α＝0.05。

2 结 果

2.1 对血清内分泌激素的影响

模型组与正常组孕酮（P）、睾酮（T）、雌二醇（E2）、垂体促乳素（PRL）指标比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。乳增宁高、低剂量组，乳癖消外敷组与模型组比较，差异均有统计学意义，提示3组药物均可提高血清P、E2、PRL的水平（P＜0.05），降低T的水平，以乳增宁高剂量组作用最为显著（P＜0.05），见表1。

2.2 对乳腺增生大鼠导管上皮层数、腺泡数的影响

模型组与正常组比较，导管上皮层数、腺泡数明显增多（P＜0.05）。与模型组比较，其余3组大鼠的乳腺增生程度均有不同程度的改善。乳增宁高、低剂量组，乳癖消外敷组与模型组比较，增生程度均低于模型组，导管上皮细胞层数、腺泡数明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05），3组间导管上皮细胞层数、腺泡数差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表1 各组孕酮、睾酮、T、E2、PRL指标比较（±s，pg/mL）

表1 各组孕酮、睾酮、T、E2、PRL指标比较（±s，pg/mL）

注：与正常组比较，cP＜0.05，与模型组比较，aP＜0.05，与乳增宁高剂量组比较，bP＜0.05

组 别 n P T E2 PRL正常组 10 12.1±5.4 18.2±4.9 99.4±56.2 6.11±0.27模型组 10 15.2±10.7c 16.8±7.8c 681.6±78.2c 8.43±0.31c乳增宁膏低剂量组 10 18.7±7.4ab 9.9±4.2ab 781.3±122.3ab 7.23±0.33a乳增宁高膏剂量组 10 29.1±9.1a 7.1±5.3a 834.0±87.6a 7.11±0.46a乳癖消外敷组 10 19.3±6.9ab 10.1±3.9ab 786.6±99.3ab 7.13±0.36a

表2 乳增宁膏对乳腺增生大鼠导管上皮层数、腺泡数的影响（±s）

表2 乳增宁膏对乳腺增生大鼠导管上皮层数、腺泡数的影响（±s）

注：与正常组比较，aP＜0.05，与模型组比较，bP＜0.05

组 别 n 导管上皮细胞层数 腺泡数正常组 10 3.27±0.87 4.41±0.57模型组 10 7.81±0.91a 16.12±1.68a乳增宁膏低剂量组 10 2.45±0.68b 7.23±0.33b乳增宁膏高剂量组 10 2.77±0.78b 7.11±0.46b乳癖消外敷组 10 2.61±0.57b 6.89±0.4b

2.3 对ER、PR表达的影响

ER、PR阳性判断标准为乳腺导管和小叶上皮细胞核着色时为阳性。对阳性细胞率取积分，计算各组ER、PR积分，具体参照文献[2]拟定。分值愈高表明ER、PR含量愈高。结果提示乳增宁高、低剂量组能降低乳腺病理组织ER、PR积分，与模型组比较有显著性差异（P＜0.01），提示乳增宁能减少乳腺组织ER、PR的含量。其作用主要是通过减少ER和PR的数量，减少E对受体的感受性，抑制乳腺组织的增生，见表3。

表3 对乳腺增生大鼠ER和PR的影响（±s）

表3 对乳腺增生大鼠ER和PR的影响（±s）

注：与正常组比较，aP＜0.05，与模型组比较，bP＜0.05。与与乳增宁高剂量组比较，cP＜0.05

组 别 n PR积分 ER积分正常组 10 2.49±0.27 2.43±0.32模型组 10 4.71±0.61a 4.61±0.61a乳增宁膏低剂量组 10 2.56±0.43bc 2.64±0.49bc乳增宁膏高剂量组 10 2.81±0.51b 2.85±0.56b乳癖消外敷组 10 2.31±0.48bc 2.21±0.38bc

2.4 对乳腺增生患者免疫功能的影响

本组主要对乳增宁高、低剂量组与正常组免疫指标变化进行了统计。结果提示：与正常组比较，乳增宁高剂量组对各个免疫指标有较为明显的提高作用，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表4 对乳腺增生患者免疫功能的影响（±s）

表4 对乳腺增生患者免疫功能的影响（±s）

注：与治疗前比较，aP＜0.05

免疫指标 正常组 乳增宁膏低 乳增宁膏高(n=10) 剂量组(n=10) 剂量组(n=10)CD3(%) 68.93±5.44 70.10±3.98 74.21±4.98a CD4(%) 40.78±4.29 41.02±3.49 44.16±4.25a CD8(%) 29.43±4.34 30.26±3.63 33.22±2.98a CD4/CD8 1.51±0.33 1.57±0.29 1.67±0.58a

3 讨 论

乳腺增生病是乳房的一种非炎症性疾病，又称乳腺小叶增生、慢性囊性乳腺病。多见于25～40岁的妇女。乳房胀痛和乳房内出现肿块为主要临床表现。近年来研究表明，乳腺癌的发生与乳腺增生病有一定的关系，乳腺上皮细胞非典型增生是重要的癌前病变，流行病学显示，非典型增生癌变危险性比正常人群增加到5倍[3]。乳腺的增生存在内分泌失调，主要是P、T分泌不足，PRL异常升高以及E2、P平衡失调，进而影响乳腺组织正常平衡性变化，雌激素的过度刺激使乳腺组织从正常到增生乃至肿瘤形成[4]。而T淋巴活性细胞是雌激素作用的主要靶器官，内分泌激素尤其是E2、P、T与免疫功能更为密切，有研究显示，乳腺增生病患者CD3、CD4/CD8值较正常值明显降低，机体自身免疫调节呈现免疫抑制状态及免疫调节功能紊乱，从而可能出现机体免疫功能低下，以致免疫系统不能有效地识别抑制和清除病变细胞而导致本病的发生。

乳腺增生病属于中医“乳癖”范畴，多由情志内伤、肝郁痰结、气滞血瘀积聚乳房胃络所致。《外科集验论》曰：“乳癖乃乳中结核，……多由思虑伤脾，恼怒伤肝，郁结而成。”《外科医案汇编》曰：“治乳症，不出一气之，定之矣”。乳增宁膏是我院刘丽芳教授多年的临床经验方进行开发研究所得，直接敷于病变部位，通过局部皮肤渗透和吸收作用及经络气血的调节作用，以改善局部血运，达到消肿止痛，软化肿块的目的。本研究选用苯甲酸雌二醇作为工具药，在一定时期内维持实验大鼠血中E2的高浓度，造成血中雌激素（E）比例失调，模型组的乳房和腺泡明显增大，乳腺小叶和腺泡增多，导管上皮增生，其组织相与人类基本一致。且模型组与正常对照组比较雌二醇显著增加，孕酮显著减少，垂体促乳素水平升高。说明在卵巢功能改变的同时，垂体功能也在发生改变，这与人类的病变相似。说明成功复制出大鼠乳腺增生模型。研究结果显示：乳增宁膏组，尤其是高剂量组能使乳腺组织对E的敏感性降低；还能调整孕激素的分泌不足，能升高血清中P，升高PRL，并与模型组比较有显著性差异。孕激素水平的提高可以对抗雌激素引起的靶组织异常增生，对靶器官的结构具有保护作用[6,7]。结果还显示乳增宁膏可抑制乳腺小叶和腺泡增多，抑制导管上皮增生；乳增宁膏对乳腺结构的保护作用与促进孕酮功能的正常发挥密切相关。实验中乳增宁膏组ER、PR含量显著低于模型组，因而可以推测乳增宁膏是通过降低大鼠乳腺组织ER、PR含量使乳腺组织对E的敏感性下降，减弱E在靶细胞上的生物学效应，从而产生抑制和治疗乳腺增生的作用。且乳增宁高剂量组对各个免疫指标有较为明显的提高作用，有效提高机体自身的免疫功能。

综上所述，乳增宁膏具有调节血清中E P、PRL激素水平的作用。其作用机制可能是通过调节实验动物下丘脑-垂体-卵巢性腺轴的功能，从而改善血清性激素的异常而实现的。

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