超声强化提取仙草黄酮及其抗氧化活性研究

朱 良 尹怀霞

仙草（Mesona Blume）又名凉粉草、仙人草，为唇形科仙草属一年生草本植物，作为一种重要的药食两用的植物资源，在我国和东南亚地区已经有悠久的历史。仙草分布于我国的广东、广西、福建、江西、海南、浙江、台湾和云南等地(谌国莲，2000)。《中药大辞典》记载：仙草性味涩、甘、寒，具清暑解渴、凉血之功效，可治中暑、高血压、肌肉及关节疼痛。仙草还可作为饲料添加剂使用，即使是水提取后的渣，也可以用作饲料(刘晓庚,2004)。刘富来等(2009)选用仙草全草煎液，应用于鸭群，对禽大肠杆菌和沙门氏菌病有较好抑制效果。

黄酮化合物是在植物体中广泛存在的一类天然产物，具有抗心脑血管疾病、抗衰老、抗氧化、消炎镇痛、免疫调节、降血糖等多种重要的生理功能(张培成，2009)。仙草中黄酮类化合物的含量超过5.0%(何明祥,2008)，近年发现仙草有很强的抗氧化作用，并推测其抗氧化功能与其所含的黄酮、多酚类有关(杨敏,2006)。我国仙草资源丰富，价格较低，积极进行仙草黄酮提取及其制品的研究，可促进仙草这一特种经济作物的产业化发展，提高养殖区的社会效益和经济效益。

传统的黄酮类物质提取方法有碱性水提取法、醇提取法和其它有机溶剂提取法等 (李巧玲,2003)。但是，这些方法温度高，用时长，黄酮类物质因为离子化、氧化和水解而损失(Li Hui,2005)。超声辅助提取是一种操作简单，效费比较高的技术(Wang Jing,2007)，超声空化可对细胞壁产生机械的修剪力，使细胞壁破裂，同时，超声可促进溶剂和活性成分的双向转移(Romdhane M,2002)。超声波用于辅助从植物中提取活性物质可减少溶剂用量和提取的时间，降低提取温度，有利于提取热敏感物质和不稳定的物质。

本文采用超声波强化提取仙草中的黄酮类化合物。通过正交试验确定了超声波辅助提取仙草中黄酮类物质的最佳工艺条件，同时对提取液进行了清除OH·和DPPH·作用的研究，以期为仙草的有效开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 药品与仪器

芦丁标准品购自中国药品生物制品所；1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基（DPPH·）购自Sigma公司；抗坏血酸、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、乙醇、硫酸亚铁、水杨酸等试剂均为国产分析纯；试验用水为二次去离子水。

VIS-7220N可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）；JA2003电子天平（上海精密科学仪器厂）；HH-S数显恒温水浴锅（江苏金坛医疗仪器）；XA-1型固体样品粉碎机（江苏省金坛市环宇科学仪器厂）；LD5-2A型离心机（北京医用离心机厂）。

1.3 试验方法

1.3.1 标准曲线的制备

称取110℃干燥至恒重的芦丁标准品50.0 mg，加浓度70%乙醇溶解并定容至200 ml容量瓶中，摇匀，制成0.25 mg/ml的芦丁标准品溶液；分别取该溶液 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 ml置于容量瓶中，各加水6.0 ml，再加5%亚硝酸钠1.0 ml，混匀，放置6 min，加10%硝酸铝1.0 ml，混匀，放置6 min，再加4%氢氧化钠10 ml，用30%乙醇定容，摇匀，放置15 min。以试剂空白作参比，在波长510 nm处测定其吸光度；以标准样品质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.2 超声提取工艺条件

提取时，准确称取一定量的仙草干粉，加入不同浓度提取溶剂，选取不同超声提取温度和提取时间，放入超声波仪中进行提取（提取时加回流装置，以防溶剂损失）。将提取液过滤、定容，测定吸光度，计算总黄酮含量。以每克干草所提取的总黄酮（以芦丁计）的毫克数表示总黄酮提取率。

根据新修订的协议，《所有权共有协议》有关项目不利事件的规定将被修订为：未来估计造价的进一步增加将不再触发对是否继续建设的表决，乔治亚电力能够随时自行决定是否取消该项目。

1.3.3 超声波提取仙草总黄酮正交优化试验(见表1)

表1 乙醇超声波提取法正交试验因素水平

为了确定在多因素条件下超声波提取仙草黄酮类化合物的最佳工艺，本文选择合适的参数范围，对提取温度、时间、乙醇浓度、超声波功率4个因素安排及进行L9(34)正交试验，以黄酮类化合物的提取率为评价指标，优化最佳提取工艺。

1.4 仙草黄酮的抗氧化作用

1.4.1 仙草黄酮对OH·的清除作用

在试管中依次加入6 mmol/l的FeSO4溶液2 ml，不同浓度的黄酮提取物溶液2 ml，6 mmol/l的H2O2溶液2 ml，摇匀，静置10 min，再加入 6 mmol/l的水杨酸溶液2 ml，摇匀，静置30 min后以5000 r/min转速离心5 min，于510 nm处测其吸光值。清除率计算公式为：

清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

式中：A0——用水代替抗氧化剂时测得空白对照吸光度；

Ai——黄酮提取物溶液的吸光值；

Aj——无水杨酸时黄酮提取物溶液的吸光值。每个样品测3次，取平均值。以抗坏血酸（VC）作阳性对照。

1.4.2 仙草黄酮对1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基（DPPH·）的清除作用

取一定浓度待测样品的乙醇溶液2 ml，加入2 ml浓度为0.1 mmol/l的DPPH·乙醇溶液，立即混匀，避光反应30 min，以等体积的去离子水代替样品溶液作对照组，等体积的乙醇代替DPPH·作空白组。于510 nm处测定吸光度直到读数稳定。清除率计算公式为：

清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

式中：Aj——空白组吸光值；

Ai——黄酮提取物溶液的吸光值；

A0——对照组吸光值。每个样品测3次，取平均值。以抗坏血酸（VC）作阳性对照。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线

计算得吸光度(A)对质量浓度(C)的线性回归方程为：A=11.886C-0.0079，R2=0.9993，在 10～60 mg/l范围内呈良好的线性关系。

2.2 正交试验结果与分析（见表2）

由表2可以看出，影响仙草中总黄酮提取率的因素主次顺序为：超声波功率＞提取时间＞乙醇浓度＞提取温度。由表2可知，超声波提取仙草黄酮类化合物的最佳组合为A2B2C3D2，即提取温度60℃，提取时间30 min，乙醇浓度80%，超声波功率200 W。

在最佳工艺条件A2B2C3D2进行3次平行试验，结果仙草总黄酮的得率为2.05%，高于正交试验的结果，表明这种工艺条件比较合理。

表2 正交试验结果

对试验结果进行方差分析、F检验，结果如表3所示。

表3 正交设计方差分析结果

由表3方差分析看出，在超声波提取仙草黄酮类化合物正交试验中所选择的因素和水平范围内，超声波功率因素都达到显著水平（P＜0.05），而其它各因素影响不显著。

2.3 仙草黄酮提取物对OH·的清除作用

根据1.4.1的方法，研究仙草黄酮提取物清除羟自由基的能力，以抗坏血酸作阳性对照，结果见图1。

图1 仙草黄酮提取物对OH·的清除效果

由图1可知，在仙草黄酮提取物及抗坏血酸（VC）两者对OH·均有较强的清除能力，且对OH·的清除能力随其质量浓度的增加而增大，这说明提取物含供氢体，具有提供氢质子的能力，可使具有高度氧化性的自由基还原，从而能终止自由基连锁反应，起到清除或抑制自由基的目的。当浓度小于0.8 g/l时，仙草黄酮提取物清除率不如抗坏血酸（VC）；当浓度达到0.8 g/l后，再增加浓度，提取物清除率高于抗坏血酸（VC），但两者的提高速率变缓。

2.4 仙草黄酮提取物对DPPH·的清除作用

根据1.4.2的方法，测定仙草黄酮提取物清除DPPH·自由基的能力，以抗坏血酸（VC）作阳性对照，结果见图2。

图2 仙草黄酮提取物对DPPH·的清除效果

由图2可知，仙草黄酮对DPPH·具有较强的清除作用，在所选浓度范围内，两者对DPPH·的清除能力随着浓度的增大而增强。当浓度小于0.8 g/l时，提取物清除率不如抗坏血酸（VC）；当浓度达到0.8 g/l后，再增加浓度，提取物清除率高于抗坏血酸（VC），但两者的提高速率变缓。

3 结论

通过正交试验得出，超声波辅助提取仙草中黄酮类化合物的最佳工艺条件为：提取温度60℃，提取时间30 min，乙醇浓度80%，超声波功率200 W。在此条件下粗黄酮得率达到2.05%。仙草黄酮对羟自由基（OH·）和1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基（DPPH·）均有较好的清除效果，是一种有效的外源性抗氧化剂，可通过直接或间接的途径清除氧自由基，阻断脂质过氧化的进程，其清除机理有待进一步研究。

若干篇，刊略，需者可函索）