高效液相色谱法检测分析饲料有机酸化剂中甲酸和丙酸的含量

雷 萍 黄志英

目前市场销售的饲料酸化剂甲酸、丙酸产品品种繁多，但饲料酸化剂甲酸、丙酸的分析检测方面的研究尚未见报道，酸化剂中甲酸、丙酸含量无法准确知晓。这必然影响饲料酸化剂生产的质量控制以及相关学科研究工作的开展。高效液相色谱分析法是目前食品加工工业中有机酸分析的常用方法，其特异性强、准确度高，可用于多种有机酸的同时分离检测。为此，本文在总结食品中有机酸液相色谱分析相关资料的基础上，通过对饲料有机酸化剂中甲酸、丙酸的反相液相色谱定量分析，探讨饲料酸化剂中有机酸的分析检测方法。

1 实验部分

1.1 仪器

WATERS 2695高效液相检测系统：WATERS 2487 TUV Detector，恒温超声波仪（0～60 ℃）。

1.2 试剂

甲酸、丙酸购自Sigma公司（St.Louis,MO,USA）。磷酸、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，各种样品均按说明使用。两种标准储备液浓度均为2000 μg/ml，用去离子水配制，避光4℃低温保存。其它不同浓度的工作液，用去离子水稀释得到。

试液与运行缓冲液均经0.22 μm聚丙烯滤膜过滤后再使用。

1.3 样品处理

称取饲料酸化剂约0.3 g(精确至0.0001 g)，置于磨口平底烧瓶中，加人80.0 ml纯净水超声30 min，然后转移到100 ml容量瓶中，用纯净水稀释至刻度，然后用0.45 μm聚丙烯滤膜过滤。

1.4 液相色谱条件

色谱柱：CAPCELL PAK C185 μm，4.6×250 mm；柱温：30 ℃；进样体积：20 μl；流动相：A(乙腈)： 缓冲液B（0.404 g庚烷磺酸钠用纯水溶解后，加入0.2 ml磷酸，定容至 1 L）=10： 90；流速：0.7 ml/min；波长：210 nm。

2 结果与讨论

2.1 试样提取条件的选择

超声波提取：准确称取已粉碎混匀的样品0.3 g(精确至00001 g)，加入纯净水80 ml，于超声波清洗器中分别提取 5、10、15、20、25、30 min，定容后经 0.45 μm聚丙烯滤膜过滤后直接进样。

试验表明：随着超声提取时间的延长，提取的效率有增加的趋势；提取时间为25和30 min的提取效率基本相同。为保证样品中的甲酸和丙酸能充分溶解，选择超声时间30 min。

2.2 缓冲液酸度与浓度

由于有机酸均为弱酸，易在水系流动相中发生解离而不被非极性键合相保留，通常采用酸性磷酸氢盐溶液抑制解离，改善有机酸的保留和分离。文献中大多选择磷酸氢盐溶液作为流动相。

研究表明：磷酸盐缓冲液浓度的高低影响酸存在形式的稳定性，从而影响分离效果。随着磷酸盐浓度的增加，分离效果和出峰时间受浓度的影响较小，在低浓度时也能获得好的分离效果。但当样品中含有杂质，当浓度较低时由于缓冲能力较小，会形成负峰，而高浓度的磷酸盐缓冲液会对柱子和泵产生一定的影响。

所以实验中选择在0.02%的磷酸溶液中添加少量的离子对试剂来改善甲酸和丙酸在色谱柱上的保留，既能达到较好的分离效果，又能减少对柱子和泵的损伤。

甲酸和丙酸的标样色谱如图1所示。

2.3 重现性、线性范围

在上述优化条件下，将浓度均为500 μg/ml的D-甲酸标准溶液和丙酸标准溶液连续进样7次，实验重现性良好。峰面积的相对标准偏差(RSD)按出峰次序分别为1.6%和1.9%。

图1 甲酸、丙酸标准样品色谱

配制一系列不同浓度的甲酸标准溶液（150～1400 μg/ml）和丙酸标准溶液(150～700 μg/ml)，在上述优化条件下测得峰面积，以峰面积对浓度作图，得到甲酸和丙酸的工作曲线，结果见表1。

表1 线性回归方程和线性范围

2.4 样品测定

在同一色谱分离条件下，对饲料有机酸化剂中的甲酸、丙酸进行了分离检测，其色谱图见图2，定量结果见表2。

图2 饲料有机酸化剂中甲酸、丙酸色谱

表2 饲料有机酸化剂甲酸、丙酸含量的分析结果（%）（n=5）

从色谱图(见图2)可以看出，甲酸和丙酸两种有机酸化剂的组成存在明显差异，但均含有甲酸和丙酸，且这两种有机酸色谱峰均达到较好的分离度，保留时间与相应有机酸标准基本一致。说明液相色谱可用于酸化剂中甲酸和丙酸成分分析。由表2可知，两种酸化剂中甲酸和丙酸含量明显不同，但变异系数变化程度基本一致，变异系数不超过3%，表明该方法具有较好的精密度。

2.5 回收率实验

取已知甲酸、丙酸含量的有机酸化剂各0.3 g(准确至 0.0001 g)，分别加入 10 ml 2000 μg/ml甲酸、丙酸标准贮备液，按1.3节所述样品前处理方法制备提取液，并进行液相色谱分析。依添加前后分析值的差值与实际添加量的百分比分别计算甲酸、丙酸的回收率。每种有机酸化剂中甲酸和丙酸的回收率平行测定3次。回收率结果表明，酸化剂中甲酸的回收率为98%～101%，丙酸的回收率为97%～99%，该方法表现出较高的准确性。

3 小结

采用高效液相色谱法可同时检测分析饲料有机酸化剂中甲酸和丙酸的化学含量，具有快速、简便、能使各组分较好的分离等特点，并表现出较高的准确性和精确度，其测试成本低，有一定的推广价值。

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