兔脑血吸虫病脑基底动脉缝隙连接蛋白Cx37 mRNA的表达及其意义*

林雪群,万丽丹,薛国勇,祝高春,杨 刚

脑血吸虫病是人体感染血吸虫后,血吸虫侵犯到脑部血管,虫卵的分泌和排泄产物通过血管内皮细胞进入脑内,沉积在脑组织中,形成虫卵肉芽肿、假性结核结节或瘢痕结节,其毒素作用导致脑水肿、脑软化,造成脑组织一系列病理改变〔1〕。脑血吸虫病的病理机制一直是许多学者长期关注的问题,有学者认为血吸虫虫卵激活内皮细胞的机制除涉及到细胞内信号的改变外〔2〕,还可能和内皮细胞间的缝隙连接紧密相关。因此,我们研究和观察脑血吸虫病脑血管壁缝隙连接蛋白的表达和分布,为探查脑血吸虫病的发病机理提供形态学依据。

1 材料和方法

1.1 兔脑血吸虫病模型制作 New Zealand大白兔10只,2.0～2.5kg,雌雄不拘,1%戊巴比妥钠(40mg/kg)行耳缘静脉注射麻醉后,固定在立体定位仪上,暴露颅骨,在前囟前5 mm和右外侧3 mm钻一直径为2 mm骨孔,在额极挑破脑膜,将内径0.1 mm的PE-10管向下向后沿皮层表面方向插入1 mm,管腔中可抽到清亮脑脊液,证明位于蛛网膜下腔,再将塑料管插入脑内3mm深,可见管内有脑脊液返流,通过塑料管向颅内注射血吸虫虫卵悬液0.2mL(约含虫卵5 000个),然后用502胶水封住骨孔,缝合头皮,卫生条件下饲养。

1.2 间接血凝抑制试验(IHA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)脑血吸虫病模型实验动物术后存活30d,在1%戊巴比妥钠40mg/kg行耳缘静脉注射麻醉下,抽血和脑脊液作间接血凝抑制试验(IHA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)验证。

1.2.1 间接血凝抑制试验(IHA) 按间接血凝抑制试验试剂盒(江西省血吸虫病防治研究所购置)说明书进行,具体操作如下:

在血凝板的第1孔至第8孔各加2%NRS 50μL(取pH7.6、0.01mol/LPBS 98 mL,灭能兔血清 2mL,于4℃冰箱保存即成2%NRS液),用移液器取待检血清50μL,加第1孔混匀,并从中取出50μL加入第2孔混匀后取出50μL加入第3孔,同样操作直到第8孔混匀后弃去50μL,然后每孔各加抗原 25μL,稀释过程中严防吸头的互相接触和相邻孔内液体相互污染。振荡1 min室温下(15℃以上)静置1.5～2h。观察待检血清各孔的凝集程度,以呈“++”凝集的被检血清最大稀释度为其血凝效价(血凝价)。血清的血凝价达到1∶16为免疫合格。

取阴性血清和阳性血清分别作阴性对照和阳性对照。

1.2.2 酶联免疫吸附试验(ELISA)操作:按血吸虫抗体ELISA检测试剂盒(深圳市康百得生物科技有限公司购置)说明书操作,具体操作如下:抗原用包被液(0.2 mol/L Na2CO38 mL,0.2 mol/L NaHCO317 mL,加75 mL蒸馏水,调pH 至9.6)稀释至10μ g/mL;以 100μL/孔量加入酶标板孔中,置 4 ℃过夜;弃去孔内的液体,同时用洗涤液(KH2PO4 0.2g,KCl 0.2g,Na2HPO4·12H2O 2.9g,NaCl 8.0g,Tween-20 0.5 mL,加蒸馏水至1 000 mL,pH7.2)洗3次,每次 5 min;每孔加 200μL封闭液(5%脱脂乳)4℃过夜;洗涤液洗3次;每孔加50μL不同稀释度的待检血清,同时设立阳性、阴性对照和空白对照;37℃孵育 1 h,洗涤,拍干;加H RP标记的羊抗兔IgG,每孔50μL,37 ℃孵育 1 h,洗涤,拍干;加底物液,每孔加新鲜配制的底物使用液(OPD 5 mg,底物缓冲液 10 mL,30%H2O240μL)100μL,37 ℃10-30 min;以 2 mol/L H2SO450μL 终止反应。

1.2.3 结果判断 肉眼观察:在白色背景下观察各孔显色情况,阴性对照无色,阳性对照呈明显黄色,表示试验有效。待检孔无色表示该标本为阴性,待检孔呈黄色表示该标本为阳性。酶标仪测定:以空白对照调零用酶标仪于450nm(620nm作参比波长)读取OD值,待检孔OD值大于阴性对照2.1倍者为阳性。

1.3 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测脑血吸虫病兔脑基底动脉Cx37 mRNA的表达 10只脑血吸虫病模型兔作为实验组;10只New Zealand大白兔作为对照组。各组实验动物1%戊巴比妥钠经耳缘静脉注射(50 mg/kg),麻醉后开颅取基底动脉血管组织,于冰浴的kerbs液中小心剥离其上粘附的蛛网膜,于液氮中保存备用。

1.3.1 组织总RNA提取和逆转录反应 采用异硫氰酸胍一步法,取脑基底动脉血管组织100 mg标本组织,加入预冷的 Trizol变性液1mL(洛阳华美生物工程公司购买),在玻璃匀浆器中冰上匀浆,静置5 min,其余步骤严格按Trizol提取液说明书操作。所得总RNA溶解于无RNase水中。取部分总RNA用紫外分光光度计(Bankman USA DU-640型)进行定量和纯度测定,用2%凝胶电泳检查其完整性,其余-70℃保存待用。取总 RNA 5μL,在20μL体系中以Random hexamer perimr为引物,应用AMV逆转录酶合成第1链cDNA。具体反应体系为:总 RNA 5μL 与 ribonuclease 抑制剂 0.5μL,Random hexamer perimr 1μL,65℃,5 min。然后加入第1链缓冲液 5μL,ribonuclease抑制剂0.5μL,dNTP混合液2μL,AMV逆转录酶1μL,37℃水浴1h,90℃水浴5 min。反应完后,迅速冰上冷却,室温高速离心5 s,-20℃保存。

1.3.2 PCR扩增反应 取5μL逆转录产物为模板,依次加入下述组分:10×PCR反应缓冲液5μL,dNTP混合液(2.5mmol/L)4μL,Taq DNA聚合酶1μL,Cx37 上、下游引物各 0.5μL,β-actin 上、下游引物各0.5μL,加无菌双蒸水至50μL,在PCR 合成仪中进行。实验所用引物序列为:Cx37:(antisense)5′-GAC TGG GGC TTC CTG GAG AAG-3′,(sense)5′-GCC ACC GAG ATC T TG GCC ATC-3′,可扩增长413bp 的 cDNA 片段;β-actin:5′-CAT CTC TTG CTC GAA GTC CA 3′,5′-ATC ATG T T T GAG ACC T TC AAC A 3′,可扩增长308 bp的cDNA片段。开始用92℃2 min,然后循环参数:92℃50 s,550C 45 s,72℃60 s,共30个循环,最后一个循环在62℃延伸7 min。

1.3.3 扩增产物的电泳分析 10μL PCR产物经2.0%琼脂糖凝胶中电泳分离,紫外透射分析仪观察后照相,凝胶图象分析系统对PCR的产物进行定量。以Cx37 mRNA扩增带的光密度与β-actin扩增带的光密度的比值代表细胞中mRNA的表达水平。

1.4 统计学处理 以统计学软件SPSS 10.0进行方差分析及Student-Newan-Keuls法分析处理。

2 结 果

2.1 血和脑脊液间接血凝抑制试验(IHA)和酶联免疫吸附试验(ELISA) 检测结果见表1和表2。血和脑脊液IHA和ELISA检测结果表明脑血吸虫病模型建立良好。

表1 血清免疫学检查Table 1 Immunological assay for serum

表2 脑脊液免疫学检查Table 2 Immunological assay for cerebral spinal fluid

2.2 RT-PCR法检测脑血吸虫病脑基底动脉Cx37 mRNA表达 所有样品的OD260nm/OD280nm值均在1.8～2.0之间,表明总RNA纯度较高,没有蛋白质的残余,质量可靠。总 RNA变性琼脂糖电泳结果显示28S、18S、5S条带均较为清楚(见图1),提示RNA提取较为完整、无降解。RT-PCR结果显示,正常兔脑基底动脉表达 Cx37 mRNA与 β-actin mRNA的比值为0.607±0.071,脑血吸虫病兔脑基底动脉Cx37 mRNA表达比值为1.370±0.095,与正常组比较增加了近3倍,经统计学检验具有显著性差异(P＜0.05)(见图2,3)。

图1 兔脑血吸虫病脑基底动脉Cx37总RNA凝胶电泳图Fig.1 Gel electrophoresis results of Cx37 total RNA in basilar artery of rabbits cerebral schistosomiasis

3 讨 论

血吸虫侵入体内经血循环感染到肺、肝脏和肠道组织引起血吸虫病,已被许多学者所公认〔3〕;关于肺血吸虫、肝血吸虫的动物模型早已被许多学者研究所应用。但是,由于脑血吸虫病的动物模型一直难以制作,从而使脑血吸虫病发病机理的研究受到极大的限制,尤其是虫卵究竟经过什么途径到达颅内?又是怎样经过脑动脉沉积于脑组织这一关键而又重要的问题一直备受人们的关注。

根据缝隙连接的生物特性及其作用,我们设想缝隙连接可能参与了脑血吸虫病的病理发生,在内皮细胞间隔的缝隙连接中,虫卵及其分泌物与内皮细胞的相互接触是否可能调节血管内皮缝隙连接蛋白的上调,不仅可以影响宿主的免疫反应,而且可能涉及血管内皮屏障的渗透性,从而使虫卵及其分泌物经血管内皮细胞溢出,沉积于脑组织而形成炎症性肉芽肿,引发脑血吸虫病。因此,从细胞和分子水平深入研究缝隙连接蛋白参与脑血吸虫病的分子机制,探讨血吸虫卵沉积于脑组织的途径和机理,探索脑动脉缝隙连接蛋白在脑血吸虫病发病机理中的作用,为进一步探讨脑血吸虫病的防治措施有着重要的意义。

缝隙连接是由2个位于相邻细胞膜上互相对应的半通道(hemichannel)组成,中间相隔2 nm,每个半通道是由缝隙连接蛋白六聚体结构围绕一个水相通道排列而构成连接小体(Connexon);连接小体中间的管道对接而联通相邻细胞胞浆形成GJ通道〔4〕。Cx基因家族编码一大类膜蛋白,由许多成员组成,其中至少有12种Cx,但参与体内血管壁细胞间GJ构成的连接蛋白类型主要有三种〔5〕,它们分别为Cx37、Cx43和 Cx40;血管内皮细胞以表达Cx37为主,平滑肌细胞以表达Cx43和Cx40为主。已有的研究〔6〕主要针对体内较大的弹力血管组织的研究,如主动脉、肠系膜动脉等。体内一些小动脉,如脑基底动脉等,对这些小动脉管壁上连接蛋白的表达和分布目前尚不清楚,尤其是在脑血吸虫病病理情况下,血管内皮细胞及胞间通透性的改变,可能涉及脑动脉管壁上缝隙连接蛋白的表达和分布发生变化。

我们通过观察发现,脑血吸虫病兔脑基底动脉Cx37 mRNA表达较正常兔脑基底动脉Cx37 mRNA表达明显升高,约是正常兔的3倍,可见脑血吸虫病兔脑血管壁细胞的缝隙连接结构的分布有其独特性。GJ的主要功能是参与细胞间信息传递和细胞功能活动的协调;参与细胞的分化、生长与发育;细胞可通过GJ向周围细胞排出代谢产物,减少毒物对细胞的损害,细胞还可通过GJ向周围细胞提供其所需的营养物质〔7〕。实验结果提示脑血吸虫病兔脑基底动脉高表达的Cx37 mRNA,可能涉及脑血管细胞间信息传递和细胞功能活动的改变,涉及血管内皮屏障的渗透性,从而使虫卵及其分泌物便于经血管内皮细胞溢出,沉积于脑组织而诱发脑血吸虫病。其确切的功能和和致病机制有待更深入的研究。

缝隙连接作为细胞进行信息交流的结构基础,参与脑血管组织的生理和病理过程。对脑血吸虫病脑血管壁缝隙连接蛋白的深入研究,将有利于揭示缝隙连接蛋白和脑血吸虫病之间的联系,有利于阐明脑血吸虫病的传播途径及发病机理,为进一步探讨脑血吸虫病的预防和治疗措施提供形态学资料。

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