棘球蚴原头节细胞凋亡的观察*

康金凤,胡汉华,陈 蓉,武贵臻,杜同心,丁智慧,贺晓燕

棘球蚴寄生于人体所引起的疾病称棘球蚴病或包虫病。包虫病是严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病。包虫病的治疗,目前仍以手术治疗为主。寻找有效的非手术的治疗方法是我们的研究目标。细胞凋亡是细胞死亡的一种形式,是由外界因素触发细胞内部死亡机制,最终导致的细胞自身毁灭,在细胞毁灭的过程中,一般不伴有炎症反应〔1〕,是一种理想的杀虫方式。有关寄生虫学领域的细胞调亡,相关学者已在医学原虫、医学蠕虫方面做了一些研究〔2〕,但是目前尚未见棘球蚴内原头节自身产生细胞凋亡的报道。原头节是棘球蚴的重要组成部分,并且在完成该虫生活史中起着不可替代的作用;原头节还在组织结构上与棘球蚴有许多相同或相似之处〔3-4〕。本文观察了棘球蚴内原头节自身是否存在细胞凋亡现象和探索了原头节发生细胞凋亡的可能机制,报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原头节 采自新疆乌鲁木齐屠宰场当日宰杀的新疆绵羊的肝脏或肺脏的细粒棘球蚴。将长有棘球蚴的脏器表面消毒后,分离、暴露出棘球蚴。用无菌注射器尽量吸出棘球蚴中囊液和游离的原头节。手术摘除棘球蚴囊壁并在吸出的囊液中涮洗以收集残留的原头节和小育囊。备用。

1.1.2 试剂 兔抗半胱天冬氨酸蛋白酶-1(caspase-1)(编号为BS-0169R)、兔抗半胱天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)(编号为 BS-0081R),美国ZYMED过氧化物酶标记链酶卵白素(SP)染色试剂盒,二氨基联苯胺(DAB)染色试剂盒,均购自北京博奥森生物公司。TUNEL(原位末端脱氧核糖核苷酸转移酶标记)细胞凋亡原位检测试剂盒为凯基生物科技发展有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 普通显微镜观察 直接吸取采集出来的原头节于载玻片,盖上盖玻片即可用不同倍数显微镜观察。

1.2.2 免疫组化检测 按文献〔5〕方法制作原头节组织切片。Caspase-1与caspase-3抗体浓度按1∶300稀释。切片经高压热修复,其余均按试剂盒说明操作。DAB(二氨基联苯胺)显色,苏木素复染。光学显微镜下观察。caspase-1与caspase-3均以细胞浆(可包括细胞核)被染成棕黄色为阳性,无黄染者为阴性。另以PBS代替Ⅰ抗以排除假阳性。

1.2.3 T UNEL检测 按试剂盒说明操作。原头节用4%中性甲醛固定24～48 h后,先后用琼脂糖和石蜡包埋原头节,制作厚4 μ m的组织切片。经DAB显色和苏木素复染后,显微镜观察。凋亡细胞的细胞核被T UNEL试剂染成棕黄色,正常细胞核不着色,正常细胞核可被苏木素复染成蓝色。

1.2.4 透射电镜观察 收集的原头节用无菌生理盐水洗涤1次,用4%戊二醛前固定24 h,再用1%锇酸后固定、丙酮梯度脱水、Epon812环氧树脂包埋后,用瑞典LKB-2188超薄切片机切成60nm厚,铅铀电子染色,日本JEOL1230透射电镜观察。

2 结 果

2.1 普通显微镜观察 直接采集原头节用显微镜观察,可见一些原头节结构清晰、完整,透光性良好,钙颗粒清亮而明显(图1-箭头所指);一些原头节体积缩小,透光性降低,钙颗粒变小或模糊不清,呈现枯萎征象(图1-红边框箭头所指)。

图1 显微镜观原头节形态(×400)Fig.1 Morphology of protoscolex under microscope(×400)

2.2 免疫组化检测 在收集的原头节中,在同一张切片,甚至同一个育囊中,一些原头节很少或几乎无caspase-1、caspase-3表达(图2、图 3之 箭头所指),一些原头节则呈现极强的caspase-1、caspase-3表达(图2、图3之红边框箭头所指)。而PBS代替Ⅰ抗者,所有原头节都呈阴性反应,由此也排除了假阳性。

2.3 TUNEL检测 用TUNEL法检测发现,在上述caspase-1、caspase-3强表达的原头节中同样检测到了大量调亡细胞(图4之红边框箭头所指)。检测结果与caspase蛋白表达高度一致。

图4 TUNEL检测结果Fig.4 Result detected by TUNEL assay

2.4 透射电镜观察 在收集的原头节中,正常原头节体被合胞体带向外长有排列整齐的微毛,微毛外侧有较厚的PAS阳性物质,原头节内部实质细胞呈圆形或椭圆形,细胞核大而明显,核仁居中,核内染色质比较细腻,异染色质较少(图5-A)。除正常原头节之外,还见到了典型细胞凋亡形态改变的原头节,表现为原头节皮层微毛外PAS阳性物质消失,内部实质细胞胞质浓缩,并可见凋亡小体形成等细胞凋亡特征性改变(图5-B、C)。

图5 原头节的透射电镜观察Fig.5 Observation on protoscolexby transmission electron microscope

3 讨 论

凋亡细胞由于内源性核酸内切酶的激活,核DNA被切割成许多双链DNA片段以及高分子量DNA单链断裂点(缺口),暴露出大量3′羟基末端,如用末端脱氧核糖核苷酸转移酶(TdT)将标记的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸(-dUTP)进行缺口末端标记,则可原位特异地显示出凋亡细胞,此即原位末端脱氧核糖核苷酸转移酶标记技术——TUNEL法〔6〕。T UNEL法是一种将分子生物学与形态学相结合的研究方法,可对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能准确地反应细胞凋亡时典型的生物化学和形态学特征,不仅可用于从培养细胞和组织中分离的凋亡细胞的形态鉴定,亦可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片等。TUNEL法可检测出极少量的凋亡细胞,因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用〔7〕。本文用 T UNEL法对自然状态原头节进行检测,发现有些原头节存在不同程度的细胞凋亡。

迄今为止,透射电镜仍然为最经典、可靠的判定细胞凋亡的方法,被认为是确定细胞凋亡的金标准。电镜下可清晰地观察到细胞凋亡的特征性的超微结构改变:如凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩;核染色质凝聚、边缘化,呈新月形;胞质紧实,细胞器集中,胞膜起泡;凋亡晚期的细胞核裂解为碎块,形成凋亡小体或可见凋亡小体被邻近巨噬细胞吞噬的现象,等〔7〕。本文在自然状态原头节中见到有的原头节呈现细胞质浓缩和凋亡小体形成等典型细胞凋亡改变,进一步证明棘球蚴原头节自身存在细胞凋亡的现象。

Caspase-1、caspase-3是细胞凋亡在执行阶段起中心作用的两个半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶。Caspase-1即白介素Ⅰ转化酶(ICE),与线虫自杀基因蛋白(CED-3)是同源物,其一级结构与CED-3有28%的同源性,可发挥与CED-3相似的作用。Caspase-3即相对分子质量32 000的半胱氨酸蛋白酶(CPP32),是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶。未活化的半胱天冬氨酸蛋白酶-3(Pro-caspase-3)与 CED-3有 35%同源,是 caspase家族中与CED-3同源性最高的,不论结构同源性还是底物特异性,都与 CED-3相似〔8〕。所以有人认为它是CED-3在哺乳动物中的同源蛋白。另外,有报道认为检测 caspase-3可用来区分细胞死亡的两种形式——凋亡与涨亡,认为caspase-3在细胞凋亡中发挥核心作用,而在涨亡细胞中呈阴性表达〔9〕。关于棘球绦虫细胞凋亡的具体机制目前尚不清楚。本文利用免疫组化技术,选用能与多种哺乳动物起交叉反应的caspase-1、caspase-3的多克隆抗体进行检测,并用PBS代替Ⅰ抗作阴性对照,以排除假阳性反应。结果在以上T UNEL法检测阳性的自然状态原头节中检测到caspase-1和caspase-3明显表达。这不仅进一步证实细胞凋亡的存在,也提示原头节中存在与ced-3类似的细胞凋亡基因。

作者已经在体外成功地用过氧化氢〔10〕和地塞米松联合 AT P〔11〕诱导棘球蚴原头节发生细胞凋亡,并在被诱导的原头节中检测到caspase-3活性明显增高。本文又观察到棘球蚴原头节在宿主体内自身产生的细胞凋亡现象。进一步搞清原头节产生细胞凋亡的机制,将为治疗包虫病新方法的探索提供理论依据。

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〔3〕Morsth D J.Fine structure of the hydatid cyst and protoscolex of Echinococcus granulosus[J].Parasitol,1967,53(2):312-325.

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