我国家禽戊型肝炎病毒感染情况的调查*

耿彦生,张 硕,赵晨燕,汪葆玥,田克恭,王佑春

戊型肝炎是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus,HEV)引起的急性病毒性肝炎,主要经肠道传播,既可散发也可暴发流行,我国是戊型肝炎的流行区。目前研究认为戊型肝炎为人畜共患疾病,猪是HEV的重要储存宿主和传染源〔1〕。除了猪之外,其他许多动物体内也检测到了HEV抗体,表明这些动物也存在HEV的感染〔2〕。最近美国学者从患肝脾肿大的鸡体内分离到一种新病毒,命名为禽戊型肝炎病毒(禽HEV),随后的研究发现健康鸡的体内也存在禽HEV感染〔3〕。为了解我国家禽戊型肝炎病毒的感染情况,我们分别在我国南方和北方15省、市(或自治区)采集了鸡和鸭的血清,进行了HEV抗原、抗体以及HEV RNA的检测,现报告如下。

1 材料和方法

1.1 血清样本鸡、鸭血清样本由中国动物疫病预防控制中心于2008年10-11月份采集于我国的15个省、市、自治区,每个省份选取1-2个养殖场。血清采集后低温保存和运输,到实验室后-20℃冻存。

1.2 血清HEV抗体和抗原的检测 应用北京万泰药业股份有限公司生产的戊型肝炎病毒抗原诊断试剂盒和戊型肝炎病毒总抗体(HEV-Ab)诊断试剂盒进行HEV抗原、抗体的检测。实验操作和结果判断按照试剂盒说明书进行。

1.3 HEV RNA的检测 根据血清学检测结果,对抗体阳性率较高的陕西、西藏和海南3个省份的所有血清样本以及其它HEV抗原阳性样本进行HEV核酸检测。应用北京金豪制药股份有限公司生产的戊型肝炎病毒 RNA检测试剂盒,对血清样本进行RNA提取。应用能够扩增HEV 1-4型的ORF2区域引物〔4〕和能够扩增ORF1解旋酶区域的保守的通用禽 HEV引物〔3〕,通过套式RT-PCR进行HEV RNA和禽HEV RNA检测。

前者外引物为:

内引物为:

后者的外引物为:

内引物为:

RT-PCR的反应条件与文献描述相同〔3-4〕。

2 结 果

2.1 鸡血清HEV抗原、抗体检测结果 本研究共检测来自15个省、市、自治区的鸡血清1 507份,其中54份标本为HEV抗体阳性,平均阳性率为3.58%(表1)。山西、山东和四川的标本中未检出HEV抗体,其他12个省份HEV抗体阳性检出率在1.02%至9.09%之间,不同省份之间有统计学差异;将北方省份,即天津、山西、内蒙古、山东、陕西、宁夏、新疆、西藏8省、市的平均阳性率3.28%(34/1 038)与南方省份四川、江苏、上海、广东、福建、江西、海南的平均阳性率4.26%(20/469)进行比较,并没有显著性差异(χ2=0.91,0.25＜P＜0.05)。HEV抗体阳性标本S/CO值最高为18.96,54个阳性样本的平均值为 4.51±5.84。15个省、市的1 507份鸡血清中,8个省市的26份血清HEV抗原阳性,总阳性率为1.73%(26/1 507),26份抗原阳性血清的平均S/CO值为2.44±1.82。8个省市的抗原阳性率在0.24%至11.11%之间,不同省份的阳性率有统计学差异;将南方7省市的平均抗原阳性率3.41%(16/469)与北方8省市的抗原平均阳性率0.96%(10/1038)进行比较,南方的阳性率高于北方(χ2=11.4,P＜0.05)。

2.2 鸭血清抗原、抗体检测结果 140份鸭血清取自我国南方五个省份(或市),其中10份血清为HEV抗体阳性,阳性率为7.14%(10/140),阳性样品的平均S/CO值为3.07±2.14(表2)。福建和上海的血清中分别有1份为HEV抗原阳性,平均阳性率为1.43%(2/140)。

将鸭血清的HEV抗体阳性率7.14%(10/140)与同样5省份鸡血清的平均抗体阳性率5.64%(19/337)进行比较,没有显著性差异(χ2=1.68,0.1＜P＜0.25);两者的平均S/CO值相比较也没有统计学差异。

2.3 RT-PCR检测结果 应用Nested PCR,分别以1-4型HEV基因组为基础设计的ORF2区域的引物,以及禽HEV基因组为基础设计的ORF1区域的引物对HEV抗体阳性率较高的陕西和海南的全部鸡血清样本以及其他HEV抗原阳性的鸡血清和鸭血清样本进行HEV RNA检测,检测结果均为阴性。

3 讨 论

根据基因组变异性,人和其它哺乳动物HEV主要分为四个基因型,即基因1型、2型、3型和4型。由于HEV ORF2区域氨基酸序列保守,不同基因型存在血清学交叉反应,目前认为HEV血清型只有一个〔1〕。禽HEV被归为戊型肝炎病毒属,暂定为基因5型〔2〕。研究发现基因重组禽HEV的ORF2蛋白既含有其独有的抗原表位,同时也含有与人、猪 HEV共有的抗原表位〔5-6〕。禽 HEV和人HEV(基因1型)ORF2区域在氨基酸水平具有约56%～62%同源性,ORF2蛋白抗原及相应单克隆或多克隆抗体存在交叉反应〔2-3〕。因此,应用哺乳动物HEV ORF2蛋白作为已知抗原制备的EIA试剂盒,既可检测1-4型HEV相应抗体也可以检测禽HEV抗体,但检测后者的灵敏度可能比较低。本研究中所用EIA试剂盒采用双抗原夹心法检测抗体,即通过预先包被的基因1型HEV ORF2重组蛋白抗原吸附待检血清中的HEV抗体,辣根过氧化物酶(HRP)标记的ORF2蛋白抗原再与已吸附的抗体结合,所以也能够检测禽HEV的相应抗体,并且检测的HEV抗体为血清中的总抗体,即包括HEV IgM 抗体和IgG抗体,提高了检测灵敏度〔7〕。

我国在多种家畜中检测到了HEV抗体,并且已经证实自猪体内分离到的HEV与HEV散发病例中分离到的人 HEV有高度同源性,有些散发HEV病例的发生可能与猪HEV的传播有关〔4,7-8〕。然而,虽然也有关于家禽HEV的血清流行病学的研究报告,但可能由于研究方法不一致,或者样本量比较小,禽类是否有HEV感染并没有得出明确的结论。本次研究中,鸡和鸭血清都有 HEV抗体阳性样本检出,鸡、鸭总阳性率分别为3.58%和7.14%。并且我们发现有些血清样本HEV抗体滴度很高,鸡血清S/CO值最高可达18.96,与猪血清的最高值接近〔7〕。血清中HEV抗原的出现是表明HEV感染的一个更直接指标,本研究应用HEV EIA抗原检测试剂盒进行检测,发现鸡和鸭血清中都有抗原阳性样本,阳性率分别为 1.73%和1.43%。这些结果说明我国家禽中确实存在HEV或者禽HEV的流行。

表1 鸡血清HEV抗原、抗体检测结果Table 1 Detection of anti-HEV antibody and HEV antigen in chicken sera

表2 鸭血清HEV抗原、抗体检测结果Table 2 Detection of anti-HEV antibody and HEV antigen in duck sera

在15个省份的鸡和5个省份的鸭血清样本中,分别有12个省份的鸡和 4个省份的鸭检测到了HEV抗体,不同省份之间鸡和鸭HEV抗体阳性率都有统计学差异。由于每个省份只选取了某一地区的1-2个养殖场采集标本,各省份的HEV抗体阳性率不一定能够表明该省份的真实流行情况,但可以说明不同养殖场或不同鸡群或鸭群HEV抗体阳性率存在差异。这与猪HEV感染情况的结果一致,养殖场的环境、卫生条件等影响猪HEV抗体阳性率〔9〕。为了解气候及地理因素是否影响禽类HEV的流行,我们将北方8省份鸡抗体平均阳性率与南方7省份的鸡抗体平均阳性率进行比较,结果未发现明显差异;但南方省份鸡血清的抗原阳性率高于北方省份,除西藏外,多数北方省份的鸡血清样本没有检出HEV抗原或抗原检出率很低。HEV感染通常为急性,HEV抗原阳性表明家禽正处于急性感染期。本次研究的血清标本采自10-11月份,此时北方逐渐变得寒冷、干燥,而南方依然炎热、潮湿。此结果表明,HEV在家禽中的传播可能会受地理、气候的影响,但仍需进一步研究确证。来自南方五省份的鸭血清的HEV抗体阳性率与同样五省份的鸡血清阳性率进行比较,没有明显差异。

哺乳动物HEV是否能够跨种属感染禽类,目前还不清楚。但最近我国学者报告,在一个相对封闭的野生动物园的鸟类粪便中分离到了两株4型HEV〔10〕。本次研究所应用的检测HEV的PCR引物为HEV ORF2简并引物,高度保守,除人和猪HEV外,最近应用此引物在兔血清中检测到了HEV RNA〔11〕,但在 HEV 抗原阳性26份鸡血清和2份鸭血清中,以及抗体阳性率较高省份的其它鸡、鸭血清中,没有检测到哺乳动物 HEV RNA。禽HEV感染在美国等国家鸡群中普遍存在〔2〕,但到目前为止我国还没有分离到禽HEV。本次试验,我们应用美国等国家所采用的禽HEV核苷酸序列高度保守的ORF1解旋酶区域引物对抗原阳性标本和抗体阳性率较高的省份血清标本进行RT-PCR,也没有得到阳性结果。其主要原因可能是由于HEV基因组存在地理性差异〔1〕,流行于美国的禽HEV和流行于我国的禽HEV核苷酸序列差异比较大,以其为基础设计的引物与我国禽HEV吻合性差,致使RT-PCR的检测灵敏度降低。那么在我国鸡群中流行的HEV究竟是哺乳动物HEV(1-4型)跨种感染,或者是禽HEV在鸡群中流行,目前仍不清楚,还需要进一步研究。

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