细胞固定剂对GFP发光特性影响的研究

张广峰，陈祥贵，帅培强，林 琳

(1.西华大学生物工程学院，四川 成都 610039；2.四川出入境检验检疫局，四川 成都 610041)

绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)，是生物医学研究中广泛应用的标记蛋白，常以融合蛋白的形式在哺乳动物细胞中表达，以观察目标蛋白在细胞中的移动和定位。

在很多研究中，需要对细胞进行固定以便进行后续的显微观察、探针杂交或免疫化学染色。但是细胞固定过程中，固定剂选择不当或者固定程序不合理可能导致GFP荧光强度显著下降甚至荧光消失，从而不能观察到GFP的分布、定位及相关的显微结构变化[1]。因此，探索不同细胞固定剂对GFP发光特性的影响，对指导相关的实验研究具有一定的实际意义。

1 实验

1.1 细胞

HepG2细胞(ATCC HB-8065TM)购于四川大学华西公共卫生学院。HepG2细胞贴壁培养于10%胎牛血清的DMEM/高糖培养基，培养条件为37℃、5% CO2。一般2～3 d传代1次。

1.2 细胞固定剂

95%乙醇、甲醇、5%冰醋酸、丙酮、Carnoy固定液(无水乙醇60 mL+氯仿30 mL+5%冰醋酸10 mL)、4%多聚甲醛(pH值7.4)。所用试剂均为国产分析纯。

1.3 GFP在细胞中的表达

贴壁培养的HepG2细胞经0.02%EDTA+0.25%胰酶消化后制备成单细胞悬液，铺于96孔板上，每孔200 μL，37℃、5% CO2条件下培养1 d后，用表达GFP的腺病毒Ad-Pshuttle-CMV-GFP感染，感染复数(MOI)为30，48 h后用荧光显微镜观察细胞发光情况，当细胞GFP阳性率达到80%以上时，用于实验。以未经腺病毒感染的细胞作为对照。

1.4 细胞固定

将发光细胞的培养液吸去，并用PBS洗涤2次，然后加入待试固定剂200 μL，按室温、4℃分别固定5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min，固定后将固定液吸出，然后用 PBS洗涤3次。倒置显微镜(Leica DMILHC)观察固定后发光情况并拍照。

1.5 酶标仪测发光值

经不同固定剂固定的96孔板上细胞用荧光/化学发光酶标仪(TECAN F200)测发光值(激发波长485 nm，发射波长535 nm)。对比固定前后发光值，按下式计算GFP荧光保存百分率(F)：

2 结果与讨论

2.1 荧光显微镜观察固定剂对细胞GFP发光的影响

HepG2细胞经腺病毒Ad-Pshuttle-CMV-GFP感染，48 h后80%以上细胞表达GFP。在感染复数为30时，细胞未见明显病变。表达GFP的细胞用不同固定剂处理后，在显微镜下观察GFP发光情况，结果见图1。

图1 不同固定剂对细胞GFP发光的影响(室温5 min)

由图1可以看出，在室温下，Carnoy固定液、甲醇、5%冰醋酸固定5 min后，细胞GFP荧光基本消失，95%乙醇固定导致GFP强度显著降低，而丙酮和4%多聚甲醛固定30 min后仍然可观察到足够强的荧光。

2.2 酶标仪检测固定剂对细胞GFP发光的影响

细胞用不同固定剂进行固定，用荧光酶标仪检测细胞发光值，结果见图2。

图2 室温(a)和4℃(b)固定后细胞GFP荧光保存百分率

由图2可以看出，无论在室温还是4℃进行固定，Carnoy固定液、95%乙醇、甲醇、5%冰醋酸处理5 min就使得GFP发光值降低到25%及以下。而4%多聚甲醛和丙酮处理5 min对GFP发光无显著影响；但是随着处理时间的延长，GFP发光值逐渐降低；当处理时间达到30 min时，4%多聚甲醛固定的细胞和丙酮4℃固定的细胞仍可保存大约40%的发光值。

2.3 讨论

细胞和组织固定剂种类繁多，应根据不同的组织、细胞类型及不同的实验目的进行选择。甲醇、乙醇、丙酮和多聚甲醛是生物医学实验中最常用的固定剂，冰醋酸和Carnoy固定液用于一些特定的细胞和组织切片。尽管GFP广泛用于生物医学的研究，但是对于组织细胞固定过程中GFP发光特性变化的研究报道很少，实验人员只能从相关的文献报道中收集零星的信息来作为指导。但遗憾的是，大多数文献对细胞固定方法的描述非常简单，使经验不丰富的实验人员难以准确把握。从已有的文献报道来看，表达GFP的细胞的固定大多数采用多聚甲醛，能有效地保持GFP的发光特性，这与本实验研究结果一致。但是，在实验中发现，为了保持GFP的发光特性，配制多聚甲醛时必须将其pH值保持在中性，否则会导致GFP荧光消失。

本实验研究结果表明：丙酮是保持GFP荧光特性的另一可选的细胞固定剂。在4℃用丙酮固定30 min后，细胞仍可保持足够强的荧光。为了保证良好的固定效果，丙酮固定最好在低温下进行。由于丙酮和多聚甲醛固定细胞机制不同，因此可为不同目的的实验研究提供选择。

有文献报道甲醇固定可保持细胞内GFP的发光特性[2]，但一般认为甲醇可能导致GFP发光强度的减弱[3]。李荣芳等[4]研究表明，甲醇固定会导致细胞在进行免疫组织化学过程中GFP荧光消失。本实验发现，甲醇和乙醇在室温或4℃时固定细胞均会导致GFP荧光的迅速消失，在较低的温度下(如-20℃)用甲醇或者乙醇固定细胞可部分保留GFP的荧光特性，国外也有文献报道将甲醇、乙醇单独或者与丙酮、甲醛混合作为细胞固定剂，但除非特定的实验需要，建议采用多聚甲醛或丙酮固定细胞以保持GFP荧光特性。

3 结论

采用6种细胞固定剂分别在室温和4℃条件下对表达GFP的HepG2细胞进行固定，并对其发光特性进行了研究。结果发现，无论是在室温还是在4℃条件下，95%乙醇、甲醇、5%冰醋酸、Carnoy固定液固定细胞后绿色荧光迅速消失，而丙酮和4%多聚甲醛固定细胞后仍可保持足够强的绿色荧光，但保留的荧光强度随固定剂作用时间的延长和作用温度的升高而降低。因此，对表达GFP细胞进行固定时，宜选择丙酮和4%多聚甲醇作为固定剂，并降低作用温度和缩短作用时间，有利于保持细胞的绿色荧光。

[1] Mans Ehrenberg，罗文新，夏宁邵(译).绿色荧光蛋白——发现、表达和发展[J].生物物理学报，2008，24(6)：422-429.

[2] Girotti M，Banting G. TGN38-green fluorescent protein hybrid proteins expressed in stably transfected eukaryotic cells provide a tool for the real-time，invivostudy of membrane traffic pathways and suggest a possible role for ratTGN38[J].Journal of Cell Science，1996，109(12)：2915-2926.

[3] Carraway Kermit L，Carraway Coralie A Carothers. Cytoskeleton： Signalling and Cell Regulation： A Practical Approach[M].Oxford:Oxford University Press，2000：114.

[4] 李荣芳，袁慧，刘定干.甲醇固定导致绿色荧光蛋白的荧光消失[J].细胞生物学杂志，2007，29(2)： 303-304.