串联色谱分离床层的制备及表征

张裕平,陈娜,杨胜凯

（河南科技学院,河南新乡 453003）

毛细管填充柱、开管柱和整体柱在色谱和电泳中的应用,揭开了纳升及微升级样品快速分离分析的新篇章[1-3].整体柱可通过形成无机硅胶网络,或有机骨架（如甲基丙烯酸酯类、聚苯乙烯类和聚丙烯酸酯类）等多种制备方法来实现[4,5].原位聚合制备大多数有机聚合物整体柱,一般常采用紫外光引发和热引发方式来完成[6-8],但是聚合反应也可以通过电离辐射（如电子束、γ和X-Ray）、红外线、微波甚至超声引发来实现[9].传统热引发由于传热慢聚合时间长,而光引发必需使用紫外透明涂层的毛细管使得价格昂贵.与传统方法相比,微波聚合具有直接、快速、灵敏、等优点[10].材料和微波之间的相互作用直接,一旦电磁场形成,聚合溶液能马上反应,材料中的所有分子都处于电磁场中,随辐射深度增加场强减弱.

本文先采用微波引发,原位聚合制备了疏水性甲基丙烯酸酯整体床层,这一部分既可作为分离介质,亦可作柱塞或者预柱材料,然后用高压匀浆法填充C18颗粒的固定相,从而得到串联的反向材料.用我们自组装的微流液相系统对其进行了色谱评价,基线分离了硫脲、苯、甲苯和乙苯四种物质,未发现所制备的毛细管柱的前端床层有明显的塞板效应.此外,自组装的微流液相色谱仪,由于采用了分流系统可获得纳升级进样及稳定的流速,采用的毛细管在线紫外检测器可提高灵敏度,实现串联床层色谱性能的有效评价.

1 试验

1．1 仪器与试剂

Agilent 3DCE电泳仪；Agilent 1100型高效液相色谱仪；Quanta 200扫描电子显微镜（FEI,Hillsboro,Oregon）；紫外检测器配在柱毛细管检测池（检测波长在190～700 nm,北京彩陆科学仪器有限公司）；实验中波长选择为200 nm,柱温为室温；N2000色谱数据处理软件（浙江智达信息工程公司,浙江大学）；弹性石英毛细管柱（100 μm I.D.,375 μm O.D.；75 μm I.D.,375 μm O.D.,河北省永年锐沣色谱器件有限公司）；微波炉（频率2 450 MHz,功率700 W,广州美的公司）；分析天平（北京Sartorius）.

γ-2-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷（γ-MAPS,New Jerse,USA）；偶氮二异丁腈(AIBN)；甲基丙烯酸丁酯（BMA,New Jersey.USA,使用前用5%NaOH萃取除去阻聚剂）；己二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA,New Jersey,USA,使用前用10%NaOH萃取除去阻聚剂)；2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸 （AMPS,北京百灵威）；正丙醇、1,4-丁二醇、硫脲、苯及乙腈（天津化学试剂公司）；甲苯和乙苯（北京化学试剂公司）；实验用水为二次蒸馏水；其余试剂均为分析纯.

1．2 毛细管液相色谱串联柱的制备

毛细管预处理见文献[9-10],整体柱床层的制备如下（见图1中步骤 a、b、c）[11].

取单体 BMA 270 μL、交联剂 EDMA 150 μL、 改 渗 剂AMPS0.002 4 g的功能单体混合物(质量分数为40%),将其加入含H2O60μL、1,4-丁二醇217μL、正丙醇400 μL的三元致孔剂中(质量分数为60%)组成混合溶液,超声30 min后,加入一定量的热引发剂AIBN （单体量的1%）,超声 10 min后,通氮气 5 min.将上述混合溶液吸入到已处理过的长度为40 cm的毛细管（100 μm I.D.）中,吸入聚合溶液长度为10 cm左右,两端用橡胶塞密封,于微波炉中采用80%的功率,加热4 min.反应完成后,用甲醇在HPLC泵的作用下将未反应的单体、致孔剂、可溶性化合物冲洗出来,约1 h.填充床层的制备是采用高压匀浆法向毛细管中装填 4 μm ODS硅胶颗粒来完成 （见图1中步骤d）.用一段90 mm×1 mm i.d.的不锈钢管柱做匀浆池,毛细管的另一端通过“1/16”PEEK管和相应的PEEK接头连在匀浆池上.将匀浆液（20%固定相,甲苯/环己烷,1/1,V/V）超声10 min,赶出里面的气泡,然后用注射器打入匀浆池中.快速连接好装置,将毛细管浸入超声池中,但出口塞要保持在液面以上.在超声作用下,利用高压泵产生60 MPa的高压装柱.需要注意的是,整个装柱过程都要在超声的帮助下进行,因为这样可以使填料填充均匀.装填过程完成后,用甲醇作顶替液,连续冲洗1 h,把匀浆液置换出来.出口塞及检测窗口的制备见图 1中步骤e、f、g.顺着装柱方向,在HPLC泵的作用下,用水冲洗色谱柱,在距入口塞22.7 cm处用丁烷气体烧大概10 s,烧结的ODS固定相本身可形成出口塞.然后反向用甲醇冲洗,将不要的多余固定相冲出.在距出口塞约7.3 cm处烧去外层聚酰亚胺涂层,得到一个约2 mm检测窗口.为考察整体柱长对分离的影响,可以剪短整体柱部分的长度来控制串联柱长.

2 结果与讨论

2.1 自组装微流液相系统

试验用一个简单的分流系统、自制串联柱和在柱紫外检测器组装成微流液相系统[11-12].在一般商品化的毛细管HPLC仪上采用的是纳升级进样器,而在我们的实验中,是在进样之后,通过连接了另一根空毛细管（分流毛细管长度为4 m,内径为100 μm）的T型三通来获得合适的分流比从而控制流速的.两根毛细管通过一个PEEK接头（405 μm i.d.,1.6 mm o.d.,Upchurch Scientific Co.Ltd,USA）与T型三通相连.色谱柱中的实际流速和进样体积可以通过分流比 （分流毛细管流出的流动相质量/色谱柱中流出的质量）计算.此外,常规HPLC系统连接的检测池不适于微流液相体系,本实验使用的是毛细管电泳仪在柱紫外检测器.

2.2 串联柱的色谱性能评价

对四种模型化合物的分离实验表明串联柱表现出明显的反相色谱特征,亲水性的物质硫脲(◆)不被疏水性的整体和填充串联床层保留,最先出峰；保留物质苯(■)、甲苯(▲)、乙苯(×)按疏水性的大小先后出峰.图 2 给出了用自组装微流液相系统得到的四种模型化合物的范式方程曲线.当保持流动相ACN/H2O=70/30(V/V)不变,通过仪器软件显示的流速从0.650 mL/min升到1.200 mL/min时,在毛细管色谱柱中的实际流速是从0.369 μL/min 升至 0.617 μL/min,背压从 11.7 MPa 升至21.5 Mpa,分流比在1 729～3 162范围内改变.优化条件下所有的模型化合物可得到基线分离.图2中曲线取了10个点,每个点至少重复3次.不保留物质硫脲的最低理论塔板高度（H）达到118 μm.

图3揭示了在显示流速0.800 mL/min条件下,H随流动相比例（ACN/H2O,V/V）的变化规律,随着乙腈含量以5%ACN为步长从55%增加到80%,流动相的洗脱力增加,被分析物的保留时间从14 min减至6 min,柱效显著提高,理论塔板高度从447 μm降至103 μm.此外,分流比随流速增加的改变比随流动相比例改变要大,这可能是由于前者导致柱背压波动明显,而后者压力变化较小（分流比在1 813～2 749之间变化）.分离床层的机

械稳定性及其重要,实验在优化条件下,显示流速0.900 mL/min,ACN/H2O=70/30(V/V)时,重复进样 50次,每个峰的保留时间和分离度的相对标准偏差（RSD）分别在0.41%～0.44%,1.46%～2.69%范围内变化（见图4a和4b）.实验结果表明,所制备的串联分离床层稳定,固定相在多次分离和平衡冲洗之后,床层没有脱落,分离度和柱效没有受到影响.

为了考察整体柱长度对柱效的影响,将前端的整体床层剪去7 cm,只剩下3 cm的整体床层和原来12.7 cm的填充固定相.从图5可看出流速与H的关系,保持流动相ACN/H2O=70/30(V/V)不变,随流速以0.050 mL/min的步长从0.650 mL/min升到1.000 mL/min,经分流比计算,在毛细管色谱柱中的实际流速将从 0.397 μL/min升至0.627 μL/min （分流比在 1 574～2 087 范围内变化）,背压从11.9 MPa升至18.0 MPa.出峰顺序依然为硫脲、苯、甲苯、乙苯,不保留物质硫脲的理论塔板高度从107 μm上升到152 μm.图6给出了部分代表性色谱分离图,可以看出流速小于设定0.950 mL/min中时,模型化合物可得到基线分离.一般来说整体床层长度减少,导致了固定相长度或量减少,色谱柱效应该降低,但实验结果却发现优化条件下的柱效变化不大.这表明整体床层对分离的贡献不大,但更适合做填充微径柱的进口塞或者预柱.另外随着乙腈含量以5%ACN为步长从55%增加到80%,流动相的洗脱力增加,被分析物的保留时间从9 min减至4 min,H显著降低（未显示）.同样在优化条件下,保持显示的设定流速 0.900 mL/min,ACN/H2O=70/30(V/V),进样重复50次实验,色谱柱的背压在16.4～16.6 MPa之间变化,RSD为0.43%.保留时间和分离度重现性好,RSD分别在0.57%～0.63%和0.92%～4.86%之间.可见固定相材料经过数百次的色谱平衡、冲洗及分离后,分离床层结构仍然十分稳定,没有脱落而导致柱效显著变化.

在使用常规填充色谱柱进行分析时,一般都使用预柱进行保护,如果样品污染导致柱压急剧升高,更换预柱的柱芯材料即可.如没有预柱保护,分离柱的柱压急剧升高的话,常使用洗脱力强的流动相反冲柱子.本文制备的微径色谱串联柱,尽管柱效不高,但却类似一种预柱与分离柱的组合,如果柱污染导致柱效明显降低的话,可以方便的剪掉柱前端一定长度的整体床层,所得到的微径柱可继续使用且柱效变化不大.

2.3 串联柱结构的表征

甲基丙烯酸酯类聚合材料已被证明是一种良好的分离介质,它适用pH范围广,已广泛用于色谱分离[13].由于传统热聚合传热较慢导致反应时间较长,而光引发要使用价格昂贵的紫外透明管,都不利于它的发展.用微波聚合时间可缩短至4 min,而且采用的是普通的聚酰亚胺涂层的毛细管.形成的整体床层能够承受高达60 MPa的压力,表明聚合物与毛细管壁结合紧密.用SEM对制备的串联柱的不同部分（见图1中箭头a～g）进行了详细的表征,图7可发现整体床层部分相互连接的网络骨架大小约 1～2 μm（见图 7 所标示的 1、2、3）, 没有颗粒填料进入整体床层.在整体床层与填充床层的界面部分,可看见少量球形颗粒在高压下嵌入微米级中孔中,在填充过程中,整体床层允许离子和液体通过,但不让C18填料通过.图7中5、6显示填充均匀,在填充柱部分没有明显的裂纹.出口塞（7）在单个颗粒之间有熔融现象,是由于高温烧结固定相的原因.烧结固定相颗粒作出口塞可成功地将分离床层固定在毛细管中,经过上百次的冲洗、平衡及分离实验后床层没有移动.尽管从电镜图上看,整体网络在柱前端已成功制备且后段的C18反向色谱填料填充均匀,但在自组装的微流液相系统上所获得的理论柱效不高,这可能是由于整个系统的柱外死体积（进样和连接管）和柱内死体积（从填充床层后到检测窗口7.3 cm）造成的.

3 结论

本文用微波引发、原位聚合,并结合高压匀浆的方法制备了串联床层的色谱微径柱.所制备的甲基丙烯酸酯整体床层不仅作为填充柱的入口塞,且可作为分离介质使用.自组装的微流液相系统可用来评价串联床层的色谱性能和床层的稳定性,这种双固定相的微径柱有望在微分离领域得到广泛应用.

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