CEA蛋白、CEAmRNA的检测在大肠癌、胃癌早期诊断中的应用价值

马育华

(临沂市人民医院,山东 临沂 276003)

CEA蛋白、CEAmRNA的检测在大肠癌、胃癌早期诊断中的应用价值

马育华

(临沂市人民医院,山东 临沂 276003)

目的研究CEA蛋白、CEAmRNA在大肠癌、胃癌患者血清、癌组织中的表达,为大肠癌、胃癌的早期诊断提供理论依据。方法选取21例大肠腺癌、20例胃腺癌住院患者和40例胃肠道良性疾病患者,检测其术前血清CEA蛋白表达;用免疫组织化学法和实时荧光定量RT-PCR法检测癌组织、癌旁组织及良性胃肠道疾病组织中CEA蛋白和CEA mRNA表达。结果大肠癌、胃癌癌组织CEA蛋白及CEA mRNA的表达均高于癌旁组织及良性胃肠道疾病组织(P＜0.01,P＜0.05),胃癌组织CEA mRNA表达与血清及组织中CEA表达比较有统计学显著差异(P＜0.05);大肠癌组织CEA mRNA表达与血清CEA表达比较有统计学差异(P＜0.05)。CEA和CEA mRNA在癌旁组织和良性胃肠道组织中表达率低。结论应用实时荧光定量RT-PCR法检测组织CEA mRNA在大肠癌和胃癌早期诊断中有重要价值。

大肠癌;胃癌;组织;CEA;CEA mRNA;免疫组化

大肠癌和胃癌是源于胃肠黏膜上皮细胞的恶性肿瘤,其发生与环境、遗传、免疫尤其是饮食习惯有关,且有逐年增多倾向。癌胚抗原(CEA)蛋白、CEA mRNA在肿瘤转移、复发及判断方面应用广泛,但在胃肠道肿瘤诊断方面应用较少。2007年 10月～2008年6月,我们检测了胃肠道肿瘤患者血清、癌及其癌旁组织中CEA蛋白及CEA mRNA的表达,以探讨其在胃肠道肿瘤早期诊断中的临床价值。

1 临床资料

1.1 一般资料 选择大肠腺癌21例,男16例、女5例,年龄50～77岁,平均59.3岁;胃癌患者20例,男14例、女6例,年龄50～83岁,平均62.9岁;良性胃肠道疾病患者40例,男28例、女 12例,年龄 29～60岁,平均50.4岁,其中慢性浅表性胃炎8例、萎缩性胃炎10例、结肠息肉10例、溃疡性结肠炎12例。均经病理检查确诊,排除肿瘤性疾病。三组年龄、性别有可比性。

1.2 方法

1.2.1 血清CEA蛋白的检测 术前采集患者肘部静脉血3ml,3000r/min离心10min,取上层血清,应用放射免疫检测试剂盒(罗氏公司),放免法检测CEA蛋白(CEA＞8ng/ml为阳性)。

1.2.2 免疫组化法检测组织CEA蛋白 手术中或者活检取患者癌及癌旁(距离癌组织3cm处)取胃黏膜组织和肠壁组织(直径0.3cm),经甲醛固定,石蜡包埋,切片,厚 4um,应用免疫组化试剂盒(美国Zymed公司)、免疫组化法检测组织CEA表达。显微镜下观察检测结果。

判断标准:强阳性(++):60%以上强阳性;阳性(++):30%～60%强阳性或60%以上弱阳性;弱阳性(+):10%～30%强阳性或(和)30%～60%弱阳性;阴性(-):＜10%强阳性或30%以下弱阳性。

1.2.3 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RTPCR)法检测组织CEA mRNA,应用TRIZOL试剂盒(上海水源生物科技有限公司)提取总RNA,储存于-70℃,作为RT-PCR反应模板。上游引物5′-AGTGAGTGCAAACCGCAGTGAC-3′,下游引物 5′-T TGAGGTTCGCTCCCGAAAG-3′,片段长度 108bp。荧光探针由水源生物科技公司提供,并组成反应试剂A(10×Buffer、dNTP、Hot Start Taq DNA 聚合酶、MgCl2、上流引物、下流引物、荧光探针溶液混合物)和试剂B(尿嘧啶DNA糖基化酶、10×Buffer)。PCR 反应体系 :反应试剂 A 15μ l、反应试剂 B 12μ l、反转录产物(cDNA)3μ l,组成30μ l反应体系。反应条件:50℃1min、95℃3min各1个循环;然后94℃30s、55℃30s、72℃30s,进行 40个循环;最后仪器40℃10s冷却。结果判断:CEA mRNA阴性:拷贝数≤500/ml;阳性:108/ml＜拷贝数≤108/ml。

1.3 统计学方法 应用SPSS 10.0统计软件。数据以±s表示,率的比较用 χ2检验。P＜0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 三种患者血清CEA比较 大肠癌、胃癌、良性胃肠道疾病患者血清CEA分别为(16.8±14.1)、(13.2±8.67)、(2.26±2.13)ng/ml。见表1。

2.2 癌组织、癌旁组织、良性疾病组织CEA表达光镜下观察,CEA阳性物质存在于胞质和胞膜上,呈棕黄色颗粒,在多数组织中分布失去极性,见表1。

2.3 癌组织、癌旁组织、良性疾病组织CEA mRNA的表达 大肠癌及胃癌组织CEA mRNA为105Copy～108(106Copy)/ml;癌旁组织为 103～104(103Copy)/ml,良性胃肠道疾病为102～104(103Copy)/ml。见表1。

表1 肿瘤及良性胃肠道疾病患者血清、组织CEA和组织CEA mRNA及病理类型(例)

3 讨论

CEA是一种分子量为1.8kD的糖蛋白分子,胚胎时正常分泌,出生后迅速下降,在组织癌变过程中CEA基因可重新激活表达。1965年Gold等首先在胎儿和人大肠癌中发现CEA[1],以后研究发现,肺癌、乳腺癌、肝癌等患者中也有CEA表达。本研究结果显示,大肠癌及胃癌癌组织CEA及CEAmRNA的表达均高于癌旁组织及胃肠道良性疾病。CEA mRNA在部分癌旁组织中也有较高表达。大肠癌、胃癌和良性胃肠道疾病患者血清CEA的表达无统计学差异。因CEA缺乏特异性和敏感性,患者血清CEA水平升高并不能完全作为恶性肿瘤早期发现的标志。

研究发现,CEA广泛存在于上皮性肿瘤,尤其是腺癌组织中[3-6]。本研究中的大肠癌、胃癌均经病理HE染色证实为中或低分化腺癌,多数浸润达浆膜层。良性胃肠道疾病经病理诊断未发现肿瘤,部分病例仅表现为不典型增生。有文献报道,胃癌组织CEA阳性率30%～90%,而正常胃黏膜含量很少或无[3];Suwanagool等用免疫组化的方法研究了55例大肠癌患者,发现在CEA＞5ng/ml的35例患者中,33例肿瘤组织CEA染色阳性;在CEA＜5ng/ml的20例患者中,17例肿瘤组织CEA染色阳性[7]。本研究中大肠癌21例、CEA阳性20例,胃癌20例、CEA阳性16例,敏感性分别为95.2%(20/21)、80%(16/20),与文献报道结果相似,提示检测癌组织CEA的敏感性和特异性均高于血清CEA的检测。

20 世纪80年代后期出现了一种全新的诊断大肠癌微转移的方法,高灵敏度的实时荧光定量RTPCR,使得检测循环血癌细胞和微小残余病灶成为可能[8]。本研究应用实时荧光定量RT-PCR法检测大肠癌、胃癌组织的CEA mRNA,阳性率均为100%。大肠癌组织CEA mRNA阳性率与组织CEA比较无统计学差异,而胃癌组织CEA mRNA阳性率高于组织CEA阳性率。40例良性胃肠道疾病中有12例CEA mRNA阳性,其中6例组织CEA为阳性。癌旁组织CEA mRNA表达,明显高于组织CEA的表达,提示癌旁组织部分细胞存在CEA mRNA表达,且这一改变出现在临床病理异常之前,说明实时荧光定量RT-PCR的敏感性和特异性高于免疫组化法。本研究中CEAmRNA在大肠癌、胃癌中的表达为(105～108)copies/ml,癌旁组织中为(103～104)copies/ml,良性胃肠道疾病不典型增生中为(102～104)copies/ml。在良性胃肠道疾病无不典型增生组织CEAmRNA表达＜500copies/ml。实时荧光定量RT-PCR的检测范围为(2×105～2×108)copies/ml,＜500copies/ml定为阴性,这种设计可以排除假阳性的可能。因此,我们认为应用荧光定量 RTPCR法检测组织CEAmRNA对于大肠癌、胃癌早期诊断具有重要的临床价值。

[1]Gold P,Freedman SO.Specific carcinoembryonic antigens of the human digestive system[J].J Exp Med,1965,122(3):467.

[2]Shuster J,silverman M,Gold P,Melabolism of human carcinoembryonic antigen in xenigenic animal[J].Cancer Res,1973,33(1):65.

[3]吴继锋,杨光霖.胃癌癌胚抗原(CEA)与其组织发生关系的研究[J].中华肿瘤杂志,1992,14(1):13.

[4]Xu D,Li XF,Zheng S,et al.Quantitative realtime RT-PCR detection for CEA,CK20and CK19Mrna in peripherd blood of colorectal caner patients[J].Zheijiang Univ sci B,2006,7(6):445-451.

[5]郭振海,陈晓江.PCNA和CEA在大肠癌表达的免疫组化研究[J].伤残医学杂志,2003,11(1):57-58.

[6]廉朋,徐烨,蔡国响,等.术前CEA、CA19-9和CA50的表达水平与结肠癌临床病理特点的相关性研究-附1340例病例分析[J].临床肿瘤学杂志,2006,11(5):326-330.

[7]Suwanagool P,Fujimori J,Maeda S.Value of tissue CEA in patients with colorectal cancinoma[J].Astian Pac J Allegy Immunol,1990,8(1):33-37.

[8]赵德清.检测大肠癌患者血CEAmRNA和CK19mRNA的临床意义[D].中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士),2002,(02).

[9]龚丽明,程若川.大肠癌微转移检测的现状及展望[J].大肠肛门病外科杂志,2003,2(42):137-142.

[10]Ito S,Nakanishi H,Hirai T,et al.Quantitative detection of CEA expressing free tumor cells in the peripheral blood colorectal cancer patients during surgery with real time RT-PCR on a lightCycler[J].Cancer Letters,2002,183(2):195-203.

The applying value of CEA,CEA mRNAdetection in early diagnosis of colorectal cancer and gastric carcinoma

MA Yu-hua(Linyi people's hospital Shan Dong Linyi,276003China)

ObjectiveTo explore the epression of CEA,CEA mRNA in colorectal cancer,gastric carcinoma tissues,In order to provide the theory of early diagnosis of colorectal cancer and gastric carcinoma.MethodsThe serum CEA levels were estimated in 21patients with colorectal cancer,20patients with gastric carcinoma and 40patients with optimum gastrointestinal disease before being operated.And expression rates of CEA,CEA mRNA in carcinoma tissues,adjacent tissues of carcinoma and optimum gastrointestinal disease tissues were estimated by immunohistochemical method and real time fluorescent quantitative RT-PCR method.ResultsThe Expression rates of CEA and CEA mRNA in colorectal cancer and gastric carcinoma tissueswere higher than that of adjacent tissues of carcinoma and optimum gastrointestinal disease tissues(P＜0.01,P＜0.05).The Expression rates of CEA mRNA in gastric carcinoma tissues differed statisticly from which of CEA in serum(P＜0.05).And the expression rates of CEA and CEA mRNA in adjacent tissues of carcinoma and optimum gastrointestinal disease were low.ConclusionThe utilizing value of CEA mRNA detection in early diagnosis of colorectal cancer and gastric carcinoma was great.

Colorectalcancer;Gastric carcinoma;tissue;CEA;CEA mRNA/exprression

Q51;R735.3+4

A

1008-4118(2010)02-0003-03

10.3969/j.issn.1008-4118.2010.02.04

2009-12-01