羧甲基绞股蓝多糖的制备及其抗氧化活性研究

绞股蓝(GynostemmapentaphyllumMakino)为葫芦科绞股蓝属多年生草质藤本植物，以全草供药食兼用，味苦、性寒，具有清热解毒、补气、止咳、祛痰之功效。绞股蓝多糖具有抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、降血糖等多种药理作用[1～3]。多糖分子中的取代基对多糖的活性影响很大，因而对多糖进行结构改造有望得到活性更强、应用范围更广的多糖衍生物。多糖的化学修饰方法中，羧甲基化方法因具有制备过程简单、试剂成本低及生成物无毒性等优点，已成为一种较常用的衍生化方法[4]。作者在此对绞股蓝多糖进行羧甲基化修饰，通过红外光谱对羧甲基绞股蓝多糖(CM-GPMP)进行表征，并对其体外抗氧化活性进行研究。对研究天然产物中多糖及其衍生物的抗氧化活性[5]、开发天然抗氧化剂具有重要的现实意义。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

绞股蓝多糖，自制；二苯代苦味肼基自由基(DPPH)，美国 Sigma 公司； 36% 盐酸、 30% 过氧化氢、抗坏血酸、氢氧化钠、无水乙醇、硫酸亚铁，西安化学试剂厂；水杨酸、冰乙酸，国药集团化学试剂有限公司；邻苯三酚，天津市化学试剂六厂三分厂；氯乙酸，郑州市德众化学试剂厂。所用试剂均为分析纯。超纯水用美国Milipore超纯水系统制备。

Synergy HT型多功能酶标仪，美国Bio-Tek公司；N-1001型旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司；Alpha1-2型冷冻干燥机，德国Christ公司；FTIR-8400S型傅立叶变换红外光谱仪，德国Bruker公司；KQ-200VDE型双频数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；FA1604N型电子分析天平。

1.2 方法[6,7]

称取绞股蓝多糖100 mg悬浮于异丙醇中，搅拌1 h，加入20%NaOH溶液，室温下剧烈搅拌，加入氯乙酸0.5 g，升温至60℃，恒温反应3 h，冷却至室温，冰乙酸调pH值为中性，超纯水透析3 d，浓缩后冷冻干燥，即得羧甲基绞股蓝多糖。

1.3 分析与表征

取一定量的绞股蓝多糖和羧甲基绞股蓝多糖用KBr压片，在4000～400 cm-1范围内进行红外光谱测定。

1.4 抗氧化活性研究

1.4.1 样品溶液的配制

将绞股蓝多糖和羧甲基绞股蓝多糖用双蒸水配制成浓度(mg·mL-1)分别为0.0625、0.125、0.25、0.50、1.00、2.00的样品溶液。

1.4.2 DPPH自由基清除率测定[8,9]

配制浓度为2.0×10-4mol·L-1的DPPH无水乙醇溶液，低温避光保存。取0.1 mL样品溶液和0.1 mL DPPH无水乙醇溶液，混合，加入96孔板，在室温下避光反应30 min，然后经多功能酶标仪在517 nm下测定吸光值。空白对照组以0.1 mL样品溶剂代替样品溶液，每个浓度均做3个复孔,取其平均值，以VC作阳性对照，临用前以双蒸水配制。

1.4.3 羟基自由基清除率测定[9～11]

在96孔板中加入9 mmol·L-1FeSO4水溶液、9 mmol·L-1水杨酸无水乙醇溶液各0.067 mL、样品溶液0.1 mL，最后加入0.067 mL 9 mmol·L-1H2O2启动反应，室温避光反应30 min。于510 nm下测定吸光值。空白对照组以0.1 mL样品溶剂代替样品溶液，每个浓度均做3个复孔，取其平均值，以VC作阳性对照，临用前以双蒸水配制。

1.4.4 超氧阴离子自由基清除率测定[9～11]

在96孔板中依次加入0.090 mL pH值8.2的Tris-HCl缓冲溶液、0.1 mL样品溶液、0.01 mL 25 mmol·L-1邻苯三酚溶液，室温避光反应5 min，加入0.1 mL 8 mmol·L-1HCl终止反应，于320 nm下测定吸光值。空白对照组以0.1 mL样品溶剂代替样品溶液，每个浓度均做3个复孔，取其平均值，以VC作阳性对照，临用前以双蒸水配制。

1.4.5 自由基清除率的计算

自由基清除率依下式计算：

式中:A0为空白的平均吸光度；A1为样品的平均吸光度。

2 结果与讨论

2.1 红外光谱分析

绞股蓝多糖和羧甲基绞股蓝多糖的红外光谱见图1。

图1 GPMP(a)和CM-GPMP(b)的红外光谱

由图1可见，绞股蓝多糖经羧甲基化后，878.26 cm-1处的葡萄糖特征吸收峰减弱，1597.50 cm-1处出现了较强的COO-特征吸收峰，1424.05 cm-1处出现了与羧基相连的次甲基的剪式振动吸收峰,表明绞股蓝多糖已成功羧甲基化。

2.2 对DPPH自由基的清除作用

DPPH自由基在517 nm处有一强吸收峰，抗氧化剂可与其单电子配对而使其吸收逐渐消失。GPMP、CM-GPMP和VC对DPPH自由基的清除作用如图2所示。

图2 VC、GPMP和CM-GPMP对DPPH自由基的清除作用

由图2可见，VC清除DPPH自由基能力非常强，浓度为0.1 mg·mL-1时的清除率高达93.67%；而GPMP和CM-GPMP对DPPH自由基的清除能力相当，均不及VC。随着多糖浓度增大，CM-GPMP和GPMP清除DPPH自由基能力有所增强。当浓度为0.5 mg·mL-1时，CM-GPMP和GPMP的清除率分别为20.82%和19.39%;而当浓度升至2.0 mg·mL-1时，CM-GPMP和GPMP的清除率分别为25.71%和23.27%。由此可见，CM-GPMP和GPMP在较低浓度时对DPPH自由基均具有一定的清除能力，增加浓度,其清除能力增强不明显。

2.3 对羟基自由基的清除作用

GPMP、CM-GPMP和VC对·OH的清除作用如图3所示。

图3 VC、GPMP和CM-GPMP对·OH的清除作用

由图3可见，在所测试的浓度范围内，随着多糖浓度增大，CM-GPMP和GPMP清除·OH的能力逐渐增强，呈一定的量效关系。浓度为2.0 mg·mL-1时，GPMP、CM-GPMP对·OH的清除率分别为84.93%、67.30%,不及VC(98.63%)。羧甲基化修饰后，GPMP对·OH的清除能力有所降低，可能是由于多糖修饰后羟基数目减少的缘故。GPMP对·OH的清除能力非常强，呈一定的量效关系，表明GPMP在清除羟基自由基方面具有极大的潜力。

2.4 对超氧阴离子自由基的清除作用

图4 VC、GPMP和CM-GPMP对的清除作用

3 结论

采用溶媒法制备了羧甲基绞股蓝多糖，红外光谱分析表明多糖羧甲基化修饰成功。CM-GPMP和GPMP对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基均有一定的清除作用，浓度为2.0 mg·mL-1时，CM-GPMP对上述三种自由基的清除率分别为25.71%、67.30%、29.95%，而GPMP对三种自由基的清除率分别为23.27%、84.93%、15.24%。绞股蓝多糖经羧甲基化修饰后，其清除超氧阴离子自由基的能力有所提高，清除羟基自由基的能力下降，而清除DPPH自由基的能力变化不大。表明绞股蓝多糖可潜在地用于抗氧化剂的开发，羧甲基化修饰对绞股蓝多糖的体外抗氧化活性有一定的影响，可通过对绞股蓝多糖进行化学修饰改善其抗氧化活性。

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