电喷雾质谱法研究N-苯甲酰基-脱氢枞胺-7-酮与DNA的相互作用*

管小虹，邓慧敏，林中祥

(1.中山大学测试中心，广东 广州 510275；2.南京林业大学化学工程学院，江苏 南京 210037)

电喷雾电离(ESI)技术，在分析生物大分子(蛋白质，核酸)与药物小分子的相互作用方面具有独特优势:能够直接反映液相中分子间的非共价键相互作用，并具有快速、灵敏、可直接观测到复合物化学结合计量比等特点[1]。近年来，DNA作为药物筛选的靶模型已经受到越来越多的关注，研究DNA与药物的相互作用对药物作用机理阐释及体外筛选有重要意义[1-4]。脱氢枞胺是重要的松香改性产品、属于三环菲结构的光学活性碱。脱氢枞胺及其衍生物已被广泛应用于医药、杀菌、染料、表面活性等领域[5]。对于脱氢枞胺类衍生物，已有的文献大多是探讨它们的合成方法及应用，关于脱氢枞胺类化合物与DNA相互作用的研究少有报道。本文采用电喷雾质谱法研究了有望开发成新型药物的N-苯甲酰基-脱氢枞胺-7-酮(NBDO)[6]与4种DNA——dC6，dT6，dA6及d(AT)3的相互作用，讨论了NBDO-DNA复合物的存在形式以及NBDO与DNA的结合方式。本文的工作对于进一步深入探讨N-苯甲酰基-脱氢枞胺-7-酮与DNA的相互作用机制和研发N-苯甲酰基-脱氢枞胺-7-酮类药物具有重要的意义。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LCQDECAXP电喷雾质谱仪(美国Thermo-Finnigan公司)，Xcalibur 1.3数据处理软件。甲醇(色谱纯)购自美国Merck公司，超纯水(自制)。dC6(相对分子质量为1 674.2)，dT6(相对分子质量为1 764.2)，dA6(相对分子质量为1 818.2)，d(AT)3(相对分子质量为1 791.2)购自上海英骏(invitrogen)生物技术有限公司。N-苯甲酰基-脱氢枞胺-7-酮(NBDO，相对分子质量为403，结构见图1)由南京林业大学林中祥教授实验室合成。

图1 N-苯甲酰基-脱氢枞胺-7-酮的结构

1.2 实验方法

喷雾电压3 kV，毛细管温度250 ℃，鞘气流速15 arb，毛细管电压18 V， MS/MS碰撞气为氦气，相对碰撞能15%～20%，负离子方式扫描。

dC6，dT6，dA6，d(AT)3分别用超纯水溶解，NBDO用甲醇溶解，以上各样品均配成1.0×10-4mol/L溶液。将NBDO与DNA溶液按体积比1∶1混合后，用注射泵直接导入ESI-MS离子源，流速为2 μL/min。

2 结果与讨论

图2为NBDO与DNA混合液的电喷雾质谱图。由图2可知， NBDO与dC6，dT6，dA6，d(AT)3均可发生相互作用形成非共价复合物,且复合物离子主要以-4价形式存在。图2 A-D中的m/z518.1(100%)、m/z540.5(90%)、m/z554.0(50%)、m/z547.3(50%)分别为[NBDO+dC6-4H]4-、[NBDO+dT6-4H]4-、[NBDO+dA6-4H]4-、[NBDO+d(AT)3-4H]4-离子峰，这4种复合物离子的相对丰度及图2给出的其他质谱数据表明，以化学计量比1∶1形成的-4价复合物离子[NBDO+DNA-4H]4-比所有其他形式的复合物离子都更加稳定。此外，NBDO与dT6还可形成更高价态(-5价)的复合物离子[NBDO+dT6-5H]5-(m/z432.5)和[(NBDO)2+dT6-5H]5-(m/z512.8)(见图2B)；DNA分子中含有较多磷酸基团，在ESI-MS负电离模式下，容易失去多个质子形成多电荷负离子；相比之下，NBDO则较难负电离且只产生单电荷负离子，因此，NBDO-DNA复合物多电荷离子的形成主要取决于DNA分子的性质，复合物所带的多个电荷主要分布在DNA分子端。NBDO与dC6，dT6，dA6还可以形成化学计量比为2∶1的复合物[(NBDO)2+dC6-4H]4-(m/z618.8)、[(NBDO)2+dT6-4H]4-(m/z641.2)和 [(NBDO)2+dA6-4H]4-(m/z654.8)。NBDO与4种DNA形成的复合物在离子价态及化学结合计量比方面存在的差异，与4种DNA的分子组成及结构差异有关。NBDO与DNA分子中，分别具有酰胺基、羰基、氨基、磷酸基等极性官能团，因此容易通过分子间氢键作用形成非共价复合物[7-9]。

表1列出了对以[NBDO+DNA-4H]4-为母离子进行碰撞诱导解离(CID)分析得到的二级质谱结果。表1数据显示，[NBDO+DNA-4H]4-发生裂解所需的碰撞能不超过20%，且4种不同[NBDO+DNA-4H]4-复合物离子具有相同的裂解方式。根据4种[NBDO+DNA-4H]4-离子的二级质谱都产生-3和-4价的DNA分子离子以及-1价的NBDO分子离子、且NBDO分子负电离程度不高的结果推测，[NBDO+DNA-4H]4-复合物离子的形成可能有两种方式：①由中性NBDO分子与-4价DNA分子离子通过非共价键作用形成；②由-1价NBDO分子离子与-3价DNA分子离子通过非共价键作用形成。

图2 NBDO与dC6(A) , dT6 (B) , dA6 (C) , d(AT)3 (D)摩尔比为1∶1混合液的电喷雾负离子质谱图

表1 [NBDO+DNA-4H]4-的MS/MS谱图数据

Table 1 ESI-MS/MS analyses of [NBDO+DNA-4H]4-

母离子/(m/z)子离子/(m/z)/(相对丰度%)碰撞能量/%[NBDO+dC6]4-/(518.1)dC3-6/(556.7)/(15)18dC4-6/(417.3)/(100)[NBDO-H]-/(402.2)/(5)[NBDO+dT6]4-/(540.5)dT3-6/(586.7)/(70)15dT4-6/(439.8)/(100)[NBDO-H]-/(402.2)/(10)[NBDO+dA6]4-/(554.0)dA3-6/(604.7)/(90)20dA4-6/(453.3)/(100)[NBDO-H]-/(402.2)/(10)[NBDO+d(AT)3]4-/(547.3)d(AT)33(595.6)/(100)18d(AT)4-3/(446.5)/(80)[NBDO-H]-/(402.3)/(12)

3 结 论

N-苯甲酰基-脱氢枞胺-7-酮与dC6，dT6，dA6，d(AT)3可通过非共价键作用形成化学结合计量比1∶1和2∶1的复合物，这些复合物在电喷雾方式下电离可产生[NBDO+DNA-3H]3-,[NBDO+DNA-4H]4-,[NBDO+DNA-5H]5-,[(NBDO)2+DNA-4H]4-,[(NBDO)2+DNA-5H]5-等多种不同形式的离子，其中[NBDO+DNA-4H]4-为丰度最强和最稳定的复合物离子。[NBDO+DNA-4H]4-离子可能由[NBDO-H]-与[DNA-3H]3-和NBDO与[DNA-4H]4-两两之间发生分子间相互作用而形成。

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