五溴联苯醚(Penta-BDE)与重金属对水生无脊椎动物大型蚤Daphnia magna 存活及其繁殖的联合毒性影响*

汤保华, 祝凌燕, 周启星,2

(1．南开大学环境科学与工程学院∥环境污染过程与基准教育部重点实验室∥天津市城市生态环境修复与污染防治重点实验室，天津 300071；2．中国科学院沈阳应用生态研究所∥中国科学院陆地生态过程重点实验室，辽宁 沈阳 110016)

在水生毒理学中，通常使用质量浓度相加模型来评价混合物的联合作用效应。质量浓度相加模型概念由Loewe和Muischnek提出[1-2]，该模型的基础建立在给定的混合物中的各个成份都有一个相同的作用点[3-4]。在许多研究中，质量浓度相加是指在同一混合体系中，一种有毒成份的作用模式与另一种与之相互稀释的成份的作用模式相似，意即一种成份的作用效果能够被另一种成份完全取代或者被部分取代，并且产生等量的效应[5]。根据这种合理的药理学基础，越来越多的研究者认为质量浓度相加模型是复合毒性分析的通用解决方案[5]。

质量浓度相加模型的数学表达如下：

(1)

在数学表达公式当中，n表示混合体系中不同成份的数量，ECxi是指混合体系当中当第i种成份单独作用产生x%的效应时的质量浓度，Ci是指在该成份在混合体系中的质量浓度。公式中Ci/ECxi部分表示在混合体系中每种成份在该质量浓度下产生相对毒性大小，通常称为该成份的毒性单位。因此，在混合体系中只要每个毒性单位的和不发生改变，每种成份都能够被其它成份取代，就不会改变总体毒性的大小。如果，混合体系当中各个成份的质量浓度之和产生x%毒性效应，并且各个成份的毒性单位之和为一个毒性单位，该混合体系中的各个成份就会产生质量浓度相加作用。否则，就要评价这些混合物是否产生大于质量浓度相加作用或者小于质量浓度相加作用。

多溴联苯醚作为一种人工阻燃剂用于各种产品，例如电器，家居用品，电缆，家具以及纺织品中[6]。过去的20年中，在沉积物，鱼类，胆汁，人类乳汁，血清以及脂肪组织中，PBDEs的水平不断增加[7-8]。多溴联苯醚具有较高的疏水性，能够在生物体中持久性存在和富集[6, 9]，并且能够对藻类，无脊椎动物，鱼类以及哺乳动物产生毒性效应[10]。大部分的水生生物研究表明，例如鱼类的毒性实验，PBDEs似乎能够影响I相和II的相生物转化作用，导致脂肪肝，改变血液中葡萄糖和血细胞比容水平，同时减少产卵的孵化成功率[11, 12]。作用一种新出现的污染物，人们越来越多的关注PBDEs对于水生环境的生物毒性。

重金属广泛分布于水环境中并且对水生生物具有致毒效应，例如重金属镉(Cd)和铜(Cu)。在同一水环境中重金属与有机物有可能产生相互作用并且导致复杂的毒性效应。由于在工农业生产中的广泛应用，环境中已经发现高水平的重金属Cd和Cu[13-14]。Cu在许多生物系统中是一种必需元素，并且作为酶结构的辅助因子，具有催化性质，许多生物的生长，发育和维持当中需要这些酶参与生化反应[15-16]。已经有一些细胞机理研究表明Cu能够诱导细胞毒性[17-18]。与重金属Cu不同的地方是Cd不是生物体的必需元素，并且已经发现Cd在土壤，沉积物，空气以及水体中广泛存在。目前对于Cd的毒性机理并不是很清楚。一些研究已经表明Cd有可能产生氧化抑制[19, 20]，并且干扰生物体的正常生理过程[21]。Cd能够损害水生蚤类动物的滤食能力，同时抑制其生长和繁殖能力[22]。Winner[23]将大型蚤Daphniamagna和Ceriodaphniadubia暴露于重金属Cd中7 d，两种蚤类的体长生长与对照组相比均显著性的收到抑制。在21 d的长期暴露中，大型蚤的繁殖率是重金属Cd毒性最敏感的反应参数[24]。

目前，已经有很多种水生生物的实验证明质量浓度相加模型非常适合用于预测多种成份的复合毒性，这些成份包括工业生产和医学麻醉使用的非特异性作用物质，主要的有机物以及非活性化合物[25-29]。已经有许多研究者评价了不同污染物之间产生的联合毒性。例如，重金属铜和有机磷农药二嗪农(Diazinon)的联合对蜉蝣Ephoronvirgo幼虫的存活可以产生小于质量浓度相加作用[30]。在网纹水蚤Ceriodaphniadubia暴露于重金属铜，锌和有机磷农药二嗪农(Diazinon)的联合作用下，对于存活率和繁殖率，除了少数几个混合处理组产生了质量浓度相加作用外，其余各个处理组均产生小于质量浓度相加作用[31]。而重金属镉，铜与马拉硫磷的联合对小型海洋甲壳动物Tigropusbevicornis的死亡产生大于质量浓度相加作用[32]。

水生蚤类动物在生态系统的能量转移中起着关键作用，通常情况下大型蚤Daphniamagna作为初级消费者将能量从植物向动物转移[33-34]。因此，多种化合物的联合毒性不仅能够影响大型蚤的存活以至于影响到种群，而且还会对群落中能量的分配产影响，并最终影响群落的结构。多种化合物对水生蚤类动物的联合毒性也可以作为具有经济价值的甲壳类动物的毒性指标。因此，水生蚤类动物既可以充当反映环境胁迫对对甲壳类动物影响的环境健康指示生物，又可以用作环境化学物质安全评价的实验生物，并为各种法令提供技术支持。

本研究的目的是通过研究重金属-多溴联苯醚对淡水蚤类动物-大型蚤Daphniamagna的存活和繁殖的联合毒性，以便于分析重金属镉(Cd)，铜(Cu)与五溴联苯醚(Penta-BDE)的联合是否能够产生质量浓度相加，小于质量浓度相加，或者大于质量浓度相加三种交互作用。

1 材料与方法

1.1 实验生物与培养条件

本实验是中大型蚤生物株(62DM生物株)引自中国疾病预防控制中心，并且在本实验是条件下成功培养10 a以上。将每40只成年母蚤培养在800 mL的培养基中。根据OECD实验准则，使用M4培养基[35]。培养基中轻微充氧，并且2周更换1次，抛弃在这期间出生的幼蚤。将绿藻-羊角月牙藻Pseudokirchneriellasubcapitata与莱哈衣藻Chlamydomonasreinhardtii按照3∶1的比率混合作为大型蚤的食物。对于所有处理组，实验温度控制在(20±1) ℃，光照周期为光:暗，16 h∶8 h。这些培养条件能够确保大型蚤始终处于孤雌生殖状态。

1.2 受试化学品

五溴联苯醚(penta-BDE)是一种用于商业阻燃剂的混合产物，在众多溴代阻燃剂中编号为DE-71。本实验所使用的五溴联苯醚购自Great Lakes Chemical Company, USA。该混合物中每种成分的含量(w)为： BDE-47, 46.0%; BDE-100, 12.6%; BDE-99, 36.7%; BDE-85, 1.3%; BDE-154, 2.1%; BDE-153, 1.3%[36]。将Pe-BDE溶于分析纯级的二甲基亚砜(DMSO)中，配制成高质量浓度的储备液，其中DMSO购自天津康科德技术有限公司。根据预实验的结果，在溶剂对照中，低质量浓度的DMSO没有对大型蚤的生存和生化反应产生影响。实验所用的Pe-BDE的贮存液和实验液都由OECD实验准则中推荐的重配水配制而成。两种重金属Cd、Cu的贮备液配制：分别将一定量的分析纯级的重金属盐(CdCl2·2.5H2O、CuSO4·5 H2O和ZnSO4·7 H2O)溶于去离子水中(Milli-Q; 18 MΩ·cm-1)。进行预试验和正式试验时，将一定量的3种重金属贮备液加入大型蚤培养基中配制成不同质量浓度。在正式实验中分别将不同质量浓度的受试化学品的母液以一定体积加入到OECD实验准则中推荐的稀释水和M4培养基中。

1.3 急性毒性和繁殖毒性实验

半数抑制实验中所需的大型蚤(D.magna, <24 h)取自第3到第8胎的幼蚤。将分析纯级的DMSO加入到溶剂对照组中，并且使得其质量浓度等于One-TU Pe-BDE中DMSO的质量浓度。为了测定重金属与Pe-BDE的混合物对大型蚤活动的抑制，将幼蚤(<24 h)暴露于17个处理组中(参见表1)，每个处理组设置3个重复，每个重复放入10只幼蚤。实验中所要进行的重金属与有机物的组合分别为：Cu+Cd, Cd +Pe-BDE, Cu+Pe-BDE, 和 Cu+Cd+Pe-BDE。

根据OECD实验准则[35]，采用连续暴露的方式测定3种化合物对大型蚤的繁殖能力损伤。根据表1设置15个处理组。同时设置空白对照组和溶剂对照组，其溶剂量与试验组中溶剂量相对应。每个处理组设置10个重复，每个重复放入1只幼蚤(<24 h)。在21 d的试验周期内，处理组和对照组的大型蚤均需饲喂，饲喂量和频率与驯养期相同。每隔24h更换试验液，计数每个母蚤所产幼蚤数量，并将幼蚤移出试验容器。对照组中受抑制或死亡的母蚤数应小于20%。对照组中每只存活母蚤21天所产幼蚤的平均数应大于60只，并且对照组中母蚤不应产出雄性幼蚤。

表1 在一个毒性单位中每种化合物所占比例

1.4 统计分析

3种化合物的48 h EC50及其95%置信区间采用美国EPA概率分析程序(EPA computer probit analysis program (Version 1.5))计算。经过正式实验得出Cd，Cu和Pe-BDE的48 h LC50(One-TU)分别为：80，67.6，和165 μg/L。

为了分析3种污染物对大型蚤繁殖的联合毒性影响，混合溶液中幼蚤的预测值分别由1-TU Cd，1-TU Cu和1-TU Pe-BDE的处理组中所产幼蚤的平均数而得，即在每个混合处理组中所母蚤所产幼蚤数量的预测值是依据每种污染物在联合处理组中所占百分比分别乘以一个毒性单位的Cd，Cu和Pe-BDE所产幼蚤的平均数，然后求和而得。繁殖毒性中观测值与预测值之间的差异显著性(P<0.05)采用统计分析软件SPSS13.0进行One-samplettest 分析，并采用Student-Newman-Kerls检验对繁殖毒性中各个处理组之间的相对毒性进行多重比较分析。

2 结果分析

2.1 对大型蚤存活的影响

在本实验当中(见图1)，空白对照组和溶剂对照组中的大型蚤存活率为100%。在15个联合毒性处理组中，与50%的预测存活率相比，暴露于处理组75%w(Cd)+25%w(Pe-BDE), 50%w(Cu)+50%w(Pe-BDE)以及 75%w(Cu)+25%w(Pe-BDE)中的大型蚤的存活没有差异显著性。在所有二元金属混合物处理组中，25%w(Cd)+75%w(Cu)处理组中的大型蚤存活率显著低于预测值。除此之外，其它混合物处理组中的大型蚤存活率都显著高于预测值。

图1 急性联合毒性实验中大型蚤 (D.magna，蚤龄<24 h)存活率的观测值和预测值，及其95%的置信区间

(每个处理组中Cd，Cu和Pe-BDE的组分之和为一个毒性单位(One-TU)。*表示在P<0.05的显著性水平下具有显著性)

2.2 对于大型蚤繁殖能力的影响

经过21 d的长期繁殖毒性，在17个处理组中，空白对照组和溶剂对照组中的每只存活母蚤繁殖的幼蚤平均数均大于OECD实验指导准则中所规定的最小数量。同时，在这两个处理组中的成年母蚤的存活数量均大于20%[35]。对于其它的12个混合处理组，除了二元混合处理组中75%w(Cd)+25%w(Pe-BDE)，以及75%w(Cu)+25%w(Pe-BDE)以外，其余各个混合处理组中平均每只母蚤所繁殖幼蚤的观测值均显著大于其预测值(见图2)。在所有重金属与Pe-BDE的二元混合处理组中，可以看出随着重金属Cd与Cu的百分比的增加，每个处理组中平均每只母蚤繁殖地幼蚤的观测值和预测值均呈现逐渐减少的趋势。但是在重金属Cd与Cu所组成的二元混合处理组以及Cd，Cu与Pe-BDE组成的三元混合处理组中，平均每只母蚤所繁殖幼蚤的观测值和预测值却表现出不同的毒性模式。理论上在Cd与Cu组成的二元混合处理组中，当Cd在1-TU中的百分比增加，Cu的百分比降低，平均每只所繁殖幼蚤的预测值逐渐减少。但是，在实际观测值中，两种重金属中的任意一个在1-TU中的百分比增加到75%，平均每只母蚤繁殖地幼蚤数量都是先增加后减少。

图2 21 d的联合繁殖毒性实验中，每个处理组中平均每只母蚤繁殖的幼蚤的观测值和预测值，及其95%的置信区间

(每个处理组中Cd，Cu和Pe-BDE的组分之和为一个毒性单位(one-TU)。*表示在P<0.05的显著性水平下具有显著性)

2.3 对于大型蚤繁殖能力的相对毒性影响

通过以一个毒性单位(1-TU)的污染物为一个点，向三个方向延伸形成一个三维立体结构(见图3)，以这种方式来分析3种污染物对大型蚤繁殖能力的联合毒性的相对损伤。在图中可以看出， 3种受试污染物中Pe-BDE分别与Cd，Cu从较大含量向含量较低的方向进行质量浓度的两两组合，平均每只母蚤繁殖地幼蚤数量随着重金属含量的增加而减少，毒性呈现增加的趋势(见图3箭头所指)。根据平均每只母蚤繁殖地幼蚤数量，一个毒性单位(1-TU)的Cu处理组中平均每个母蚤所产幼蚤显著性的低于其它各个处理组。而在处理组25%w(Cd)+75%w(Pe-BDE)，以及50%w(Cd)+50%w(Pe-BDE)中平均每只母蚤繁殖地幼蚤数量显著多于其它各个处理组。

图3 重金属Cd，Cu与Pe-BDE所组成的15个处理组对大型蚤繁殖抑制的相对毒性

(三角形每个角代表一个毒性单位(one-TU)的Cd，Cu和Pe-BDE。每个圆圈表示一个处理组，圈中数字所代表的处理组参见表1。相同的字母表示处理组间不存在差异显著性(P<0.05)。箭头表示毒性逐渐增加)

3 讨论与结论

质量浓度相加效应是指污染物的联合毒性效应与一个毒性单位的预测毒性相等。在本研究中，仅仅在二元混合污染物的处理组中观察到质量浓度相加效应。对于大型蚤的存活，处理组75%w(Cd)+25%w(Pe-BDE), 50%w(Cu)+50%w(Pe-BDE)以及处理组 75%w(Cu)+25%w(Pe-BDE)；对于大型蚤的繁殖能力，处理组75%w(Cd)+25%w(Pe-BDE)，以及75%w(Cu)+25%w(Pe-BDE)，联合毒性效应的实测值与预测值之间没有差异显著性，表现为质量浓度相加作用。通常认为质量浓度相加毒性效应是在所暴露的生物体内，发生毒性效应的污染物具有相同的作用位点或者具有相同的作用模式。因此，在本研究中大部分的处理组最终没有产生相加作用效应。相反，在剩下的处理组中，联合毒性效应是小于质量浓度相加作用效用。小于质量浓度相加作用效应通常是因为混合污染物的作用位点不相同或者毒性作用模式存在差异[26,37]。

重金属通常有几个相同的毒性作用模式[17, 38-39]：①当一种金属取代了酶的必需金属辅助因子，或者金属与酶的巯基基团发生相互作用；②在细胞水平，这种酶抑制很有可能会干扰线粒体的呼吸和内质网的正常功能；③通过在溶酶体的积累和在细胞核内形成金属内含物，或者通过干扰钙离子的吸收以及与离子调节相互作用，金属也能干扰细胞的结构和功能。而Pe-BDE的基本作用模式是通过抑制乙氧基-9-羟基异吩噁唑酮-邻-去乙基酶(EROD)，减少谷胱甘肽还原酶，增加GSSG:GSH的比率，产生脂质过氧化作用产生毒性[12,40]。由于Pe-BDE和重金属不同的毒性作用模式，这也许能够解释大部分试验处理的结果。

污染物在不同水平的联合，在一些处理组中产生小于质量浓度相加作用，而在另外一些处理组中则产生质量浓度相加作用效应。这也许是在毒性单位内不同污染物的质量浓度不同而产生不同的作用效应。在单因子污染胁迫下，污染物对生物的毒害效应，基本上取决于污染物本身的物理化学性质，但同时也受暴露水平极为重要的影响[41]。然而在多元复合污染条件下，除了污染物本身物理化学性质的作用外，污染物的质量浓度组合起到了至关重要的作用[42]。另一方面由于每种污染物都有其剂量-效应曲线，并且大部分都是非线性曲线，因此每种有毒物质在联合毒性中其质量浓度为一个毒性单位的25%，50%，75%时会产生不同的毒性效应。一些研究已经证明了有毒物质在不同水平会产生不一致的毒性效应[30，43-44]。所以本研究中，同一种污染物在不同处理组中的不同质量浓度会产生不同的毒性效应。

重金属与有机污染物会经常同时存在于城市降水和城市地表水中。本文的结果表明重金属-多溴联苯醚的联合毒性似乎并不比这些污染物单独暴露时的毒性大。实际上，这些混合物所产生的复合污染往往会产生小于质量浓度相加作用。在自然生态系统，同时存在其它许多的影响因子，例如同时存在的其它污染物，或者水中的颗粒物，所有污染物的总质量浓度，水质的差异等等，这些都会影响到重金属-多溴联苯醚的联合毒性。因此，在生态风险评价中应该考虑到众多同时存在的污染物，以及它们之间复杂的相互作用，这在更大程度上更能真实的反映生态环境的状态。

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