PEG-(NH4)2SO4双水相萃取法提取壳聚糖酶的研究

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(武汉生物工程学院生物工程系，湖北 武汉 430415)

壳聚糖酶(Chitosanase，EC3.2.2.99)又称壳聚糖-N-乙酰-氨基葡糖苷水解酶，是一种分解壳聚糖的专一性酶，广泛分布在细菌、真菌、病毒以及植物等生物群中[1]。酶降解法制备壳寡聚糖具有反应条件温和、寡糖得率高、不污染环境、产物安全性高等优点，是目前的发展方向。因此，对壳聚糖酶进行深入研究并实现工业化生产十分必要。

双水相萃取(ATPS)是近年来发展起来的技术，在蛋白质、酶、核酸等生物活性物质的分离纯化方面受到广泛重视。与传统的分离方法相比，ATPS具有条件温和、产品活性损失小、处理量大、分离步骤少、无有机溶剂残留、设备投资小、操作简单、易于工程放大和连续操作等优点，非常适合大规模应用[2，3]。

目前国内对双水相萃取法提取壳聚糖酶的研究和报道较少。作者利用PEG-(NH4)2SO4双水相体系从Bacillussp.LS发酵液上清液中萃取分离壳聚糖酶，考察了影响萃取效果的各种因素，对双水相萃取技术提取壳聚糖酶进行了初步研究。

1 实验

1.1 菌种、试剂与仪器

菌种Bacillussp.LS，自行筛选得到。

壳聚糖，成都科龙化工试剂厂；聚乙二醇(PEG，分子量为400、600、1000、4000、6000)、硫酸铵、3,5-二硝基水杨酸(DNS)、考马斯亮蓝G250、D-(+)-氨基葡萄糖盐酸盐等均为分析纯。

BS110S型电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司；GL-16G-Ⅱ型高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；722S型分光光度计，上海棱光技术有限公司；PHS-3C型精密pH计，上海宇隆仪器有限公司；WH-90A型漩涡混合器，上海青浦沪西仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 粗酶液制备

低温保藏的菌种经过活化后，接种于液体发酵培养基中摇床培养，发酵液经冷冻离心后，收集上清液，4℃贮存备用。

1.2.2 PEG-(NH4)2SO4双水相体系的建立

称取一定量PEG和(NH4)2SO4配制双水相体系。体系总质量为10.0 g，其中酶液量为2.0 g，不足部分用去离子水补足。混合均匀后，3000 r·min-1离心5 min，分相。分别测定上、下相体积，上、下相酶活和总蛋白浓度。计算相比(上、下相体积之比，R)、分配系数(上、下相酶比活力之比，K)、萃取率(上相总酶活与两相总酶活之比，S)。

1.2.3 双水相体系相图的绘制

准确量取一定量的PEG原液加入试管中，然后计量加入(NH4)2SO4溶液，混合，直至试管出现混浊。计量，算出PEG和(NH4)2SO4在系统中的质量分数。再计量加入适量水，使体系变澄清，并继续加入(NH4)2SO4溶液，使系统再次变混浊。如此反复操作，计算达到混浊时PEG和(NH4)2SO4在系统中的质量分数，绘制PEG-(NH4)2SO4体系的相图。

1.3 分析与测试

1.3.1 酶活的测定

在1 mL1%胶体壳聚糖(用0.2 mol·L-1pH值5.0的醋酸缓冲溶液配制)中加入1 mL适当稀释的酶液，于50℃保温反应15 min，沸水浴10 min灭活，加入DNS 1.5 mL，沸水浴10 min，取出冷却，3500 r·min-1离心15 min，取上清液在520 nm处测光吸收值。酶活单位定义为每分钟催化生成相当于1 μmol氨基葡萄糖的还原糖所需的酶量。

1.3.2 蛋白质含量测定

蛋白质含量用考马斯亮蓝法测定[4]。

2 结果与讨论

2.1 双水相体系相图(图1)

图1 PEG600-(NH4)2SO4双水相体系相图

由图1可见，在节线的上方区域可以形成双水相。

2.2 PEG相对分子量对壳聚糖酶萃取效应的影响[5]

固定PEG的质量分数为20%、(NH4)2SO4的质量分数为15%，考察PEG相对分子量对壳聚糖酶萃取效应的影响，结果见图2。

图2 PEG相对分子量对壳聚糖酶萃取效应的影响

由图2可知，随着PEG相对分子量的增加，壳聚糖酶的分配系数和萃取率均先增大后减小，当PEG相对分子量为600时分配系数和萃取率均达到最大。因此，选择PEG600进行后续实验。

2.3 PEG质量分数对壳聚糖酶萃取效应的影响

固定(NH4)2SO4的质量分数为15%，考察PEG600质量分数对壳聚糖酶萃取效应的影响，结果见图3。

图3 PEG600质量分数对壳聚糖酶萃取效应的影响

由图3可知，(NH4)2SO4质量分数一定时，随着PEG600质量分数的增加，分配系数和萃取率均先增大后减小。这是因为随着PEG600质量分数的增加，上相和下相相对组成的差别增大，壳聚糖酶在两相中的表面张力差别也增大，有利于壳聚糖酶富集于上相中。但PEG600质量分数增加到一定程度时，成相物质间的作用增大，相界面张力亦增大，系统粘度也会增大，溶质在相间的传递和在相内的扩散阻力大大增加[6]，反而不利于壳聚糖酶进入PEG相。综合考虑，确定最佳的PEG600质量分数为20%。

2.4 (NH4)2SO4质量分数对壳聚糖酶萃取效应的影响

固定PEG600的质量分数为20%，考察(NH4)2SO4质量分数对壳聚糖酶萃取效应的影响，结果见图4。

图4 (NH4)2SO4质量分数对壳聚糖酶萃取效应的影响

由图4可知，PEG600质量分数一定时，随着(NH4)2SO4质量分数的增加，分配系数和萃取率均先增大后减小。(NH4)2SO4质量分数为20%时，分配系数和萃取率均达到最大值。随着(NH4)2SO4质量分数继续增加，影响到蛋白质表面的疏水性，进而影响到蛋白质的分配系数。因此，确定最佳(NH4)2SO4质量分数为20%。

2.5 离子强度对壳聚糖酶萃取效应的影响(图5)

图5 NaCl质量分数对壳聚糖酶萃取效应的影响

由图5可知，随着NaCl质量分数的增大，分配系数和萃取率先增大后减小，NaCl质量分数为0.1%时，均达到最大值。这是因为，NaCl粒子可能在两相中有不同的分配系数，随着NaCl质量分数的增加，两相间电位差发生变化，从而使壳聚糖酶的分配系数增加，但增加到一定的程度(超过0.1%)后，萃取相极性增强，壳聚糖酶的溶解度下降而发生盐析现象，蛋白质倾向于分配到下相，分配系数和萃取率明显下降。因此，确定最佳NaCl质量分数为0.1%。

2.6 pH值对壳聚糖酶萃取效应的影响(图6)

由图6可知，随着pH值的增加，分配系数和萃取率均先增大后减小，pH值为6.0时，均出现最大值。体系pH值对壳聚糖酶的分配有很大影响，这是由于体系pH值的变化能明显改变两相的电位差[7]， 最终影响到壳聚糖酶的分配系数和萃取率。因此， 确定萃取分离壳聚糖酶的双水相体系的最佳pH值为6.0。

图6 pH值对壳聚糖酶萃取效应的影响

3 结论

室温下用PEG-(NH4)2SO4双水相体系从Bacillussp.LS发酵液上清液中萃取壳聚糖酶，最佳提取条件为：PEG600质量分数20%、(NH4)2SO4质量分数20%、NaCl 质量分数0.1%、pH值6.0，在此条件下壳聚糖酶分配系数达5.91、萃取率达88.7%。

参考文献：

[1] 吴晓宗，王岁楼，郝莉花.壳聚糖酶的分类及其功能应用现状[J].食品工业科技，2005，26(8)：189-192.

[2] Diamond A D,Hsu J T.Aqueous two-phase systems for biomolecule separation[J].Advances in Biochemical Engineering Biotechnology,1992,47:89-135.

[3] Schmid A S,Ventom A M,Asenjo J A,et al.Partitioning and purification ofα-amylase in aqueous two-phase systems[J].Enzyme and Microbial Technology,1994,16(2):131-142.

[4] 陈毓荃.生物化学实验方法和技术[M].北京：科学出版社，2002：95-96.

[5] 邓静，吴华昌，赵树进.双水相技术在酶分离纯化中的运用[J].氨基酸和生物资源，2004，26(1)：72-75.

[6] 冯箐，夏杰，陆兵，等.人溶菌酶的双水相萃取法分离[J].华东理工大学学报，2006，32(12)：1409-1411.

[7] 杨善升，陆文聪，包伯荣.水相萃取技术及其应用[J].化学工程师，2004，18(4):37-40.