山羊原始生殖细胞分离与培养的影响因素

熊 浩，崔 雯，王杏龙，刘 翔

（扬州大学动物科学与技术学院，江苏 225009）

哺乳动物原始生殖细胞（primordial germ cells,pGGs）在一定条件下维持未分化状态，经过体外长期培养可以建立胚胎性干细胞系，称为EGCs，这也是另一来源的胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）。PGCs用于 ESCs的分离与克隆始于1992年，Matsui等［1］对小鼠PGCs长期培养，建立了EGCs系，此后，用PGCs分离与克隆ESCs又在大鼠、猪、牛、山羊等动物上取得重要进展。但是目前只在小鼠上成功建系，而在其他物种上成功建系的却不多，尤其在国内，从山羊PGCs来源培养出长期稳定增殖的ESCs并且建系成功的报道至今未见。本实验从本地白山羊的早期胎儿生殖嵴中分离PGCs，将PGCs进行培养和传代，从而得到ESCs，将其在不同的条件下培养，初步分析了各种不同条件对培养效果的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

试剂：高糖DMEM、非必需氨基酸（non-essential amino acid）：Gibco 公司；LIF、SCF：Sigam 公司；胎牛血清（FBS）：杭州四季青公司；L-谷氨酰胺（L-glutamine）、胰蛋白酶（trypsinase）、牛血清白蛋白（BSA）、胶原酶（collagenase）：上海生工生物工程有限公司。

成纤维细胞培养液：DMEM培养液+10%FBS+0.1 mmol/L β-巯基乙醇+2 mmol/L L-谷氨酰胺+1 mmol/L丙酮酸钠+100 u/mL青链霉素。

ESCs培养液：DMEM 培养液+15%FBS+0.1 mmol/L β-巯基乙醇+2 mmol/L L-谷氨酰胺+0.01 mM非必需氨基酸+1 mmol/L丙酮酸钠+100 u/mL青链霉素+不同浓度的各种细胞因子。

细胞冻存液：80%的DMEM培养液+10%的FBS+10%的DMSO，短期4℃低温保存。

1.2 方法

1.2.1 山羊胎儿成纤维细胞的制作（GEF） 本地白山羊早期胎儿从江苏省丹阳市珥玲山羊交易市场收集。要求收集到的子宫表面无严重污染。如果直接从山羊体内获取子宫，则迅速投入到4℃含有200 u/mL的青链霉素的生理盐水中；如果从屠宰后的废弃内脏中获取子宫，则以碘酊和75%的乙醇先后擦拭净子宫表面，以除去覆盖的异物，再以生理盐水冲洗子宫表面，然后剪开子宫取出胎儿（不能剪破羊膜），迅速投入到4℃的生理盐水中，收集完后带回实验室。参考王国云等［2］制作小鼠胎儿成纤维细胞的方法制作GEF，于38.5℃、5%CO2培养箱中培养。

1.2.2 饲养层的制作 选取刚好铺满瓶底，生长良好的2～4代成纤维细胞制备饲养层。

1.2.3 山羊原始生殖细胞的培养 取材方法与上同。在体视显微镜下无菌剥离胎儿生殖嵴及其周围的复合物，充分剪碎，室温（25℃）下在组织块中加入消化液，边消化边用移液器不停的吹打。以等体积的含10%FBS的DMEM培养液中止消化，摇匀，100目纱网过滤细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，去掉上清液，再加入ESCs培养液，调整细胞密度为105个/mL，于38.5℃、5%CO2培养箱中培养。24 h后观察细胞生长状况，更换培养液以去除死细胞，以后待发现培养液变黄时便换液。PGCs集落周围出现分化细胞之前应立即进行传代，传代细胞培养的条件同上。

1.2.4 试验设计

1）参照文献［3］给山羊胎儿分类的方法，取胎儿冠臀长15～30 mm的胎儿。试验设计2）～4）均采用冠臀长为15～30 mm的胎儿，室温（25℃）下消化15 min，在原代培养中使用不同浓度的消化液：0.25%胰酶+0.04%EDTA和0.125%胰酶+0.02%EDTA，比较两种消化方式对原代集落形成的影响。

2）使用以下两种方法进行传代

方法一：将观察到的典型集落的细胞培养板中的培养液吸去，然后以细玻璃针挑出集落，无菌条件下以细针离散集落块，移入离心管中，加入适量的0.05%的胰酶，以移液器吹打2～3 min，再加入ESCs培养液，然后再接种于饲养层上继续培养。

方法二：将观察到的典型集落与饲养层在0.125%胰酶+0.02%EDTA一起消化，显微镜下观察到集落开始逐渐散开时立即以等体积含10%FBS的DMEM培养液中止消化，将细胞悬液转移至离心管中，吹打摇匀，1 000 r/min离心5 min，去上清液，加入ESCs培养液，先将细胞悬液置于培养瓶中，放在培养箱中培养45 min，然后小心倾斜培养瓶，倒出培养液于饲养层上，这样可以除去一部分贴壁的成纤维细胞，再接种于新的饲养层上进行培养。

比较两种不同传代方式对细胞传代的影响。

3）以第一步实验为结果，选取最好的饲养层培养方式，然后在培养基中添加不同浓度的因子：①LIF：10 ng/mL;②LIF：20 ng/mL;③LIF（10 ng/mL）+SCF（10 ng/mL）；④LIF（20 ng/mL）+SCF（20 ng/mL），比较不同培养方式下原代和传代培养的效果。

4）选取冠臀长小于15 mm胎儿和大于30 mm的胎儿进行培养，比较以这两种冠臀长的胎儿为材料培养PGCs的效果。

1.2.5 AKP染色鉴定 室温下，吸去培养液，以PBS溶液清洗3次；以4%多聚甲醛固定10 min（此时配制显色液：向 1mL超纯水中加入一滴 A（NBT）和 B（BCIP）液，混匀后静置）；吸去多聚甲醛，加入适量的显色液，暗室放置10～30min，期间观察，以便拍出不同的显色效果。

2 结果与分析

2.1 PGCs的生长 刚分离的PGCs在体外培养时，开始培养的初期是处于游离期的。24 h以后可见小的集落形成，72 h后就可以见到明显的集落形成。山羊PGCs呈山苞状、鸟巢状和岛状，形态不规则，凸起于成纤维细胞饲养层之上，集落与周围的成纤维细胞联系较为紧密，集落内的细胞间隙不明显。传代后即EGCs，山羊EGCs在24～48 h内也会形成小的集落，培养到约72 h后可见明显的集落形成，与ESCs的生长行为类似，培养到5～6 d后在显微镜下可见到很典型的克隆突出于饲养层表面，与PGCs具有相似的形状。

2.2 不同胰酶浓度的消化对原代集落和传代的影响 以0.25%胰酶+0.04%EDTA和0.125%胰酶+0.02%EDTA两种浓度消化液进行消化，结果发现，在室温下消化15 min的时候，前者消化得到的原代集落的形成率较高（120%），而后者的消化的效果不好（25%），传代数也低于前者，两者差异显著（P＜0.05）。

图1 山羊原始生殖细胞（GEF饲养层）100×

图2 山羊胚胎生殖细胞（GEF饲养层） 200×

表1 不同胰酶浓度的消化对原代集落和传代的影响

2.3 不同传代方式对传代的影响 以结果2.2中的原代集落为样本，以两种方式进行传代，结果发现无论是挑取集落传代还是以0.125%胰酶+0.02%EDTA消化传代，均能将PGCs传至2代。第1代集落的形成率分别为42.9%和57.1%，第2代集落形成率分别为14.3%和28.6%，结果表明两者无显著差异（P＞0.05），在本次试验中两种传代方式都适合于PGCs的传代培养。

表2 不同传代方式对传代的影响

2.4 不同种类和浓度的细胞因子对PGCs原代和传代的影响 在培养液中添加不同种类和浓度的因子，以GEF为饲养层培养，结果如表3所示，统计每组每次形成的集落个数，每个组重复3次。结果显示，无论使用LIF还是LIF+SCF都可以使PGCs进行传代培养，而增加两种细胞因子的浓度似乎与原代和传代培养的效果无关，两者差异不显著（P＞0.05），且均能将原代集落培养至第2代。

表3 不同种类和浓度的细胞因子对PGCs原代和传代的影响

2.5 不同胎龄段山羊PGCs培养的效果 本次试验采用冠臀长小于15 mm和大于30 mm的胎儿进行培养，如表4。采样4个胎儿为冠臀长小于15 mm，只有1个原代集落形成，且没有能够传代；而采样的6个冠臀长大于30 mm的胎儿中没有形成原代集落，试验结果也证实了只有冠臀长在15～30 mm的胎儿的生殖嵴适合于培养PGCs。

表4 不同胎龄段山羊PGCs培养的效果

2.6 山羊PGCs的鉴定 AKP染色鉴定结果如图3、图4。PGCs和EGCs被染成红棕色，与ESCs染色结果一样呈阳性。

图3 AKP染色的PGCs（GEF饲养层）100×

图4 AKP染色的第2代EGCs 100×

3 讨论

3.1 细胞因子的影响 在从PGCs中分离ESCs时，多数学者不但使用了饲养层，同时还在培养液中添加各种细胞因子，细胞因子一方面抑制ESCs的分化（分化抑制因子），另一方面刺激细胞的分裂增殖（生长因子）。李松[4]研究发现，采用牛PGCs与其胎儿成纤维细胞共培养的方式添加细胞因子与否对牛PGCs分离的影响并不显著，而传代过程中则最好添加因子，培养基中添加细胞因子与否对PGCs的原代集落形成和传代有重要影响，可能是饲养层分泌的因子远远不能维持PGCs的生存和未分化状态，必须要添加外源因子。葛秀国等［5］以3个不同质量浓度LIF的培养液培养PGCs，在原代培养时，效果差异不显著（P＞0.05）；而在传代过程中，以含LIF 10 ng/mL组培养效果最好，但与含LIF 5ng/mL组差异不显著（P＞0.05），而LIF 1 ng/mL组培养效果较差（P＜0.05）。杨丽芬［6］研究结果为，添加LIF+SCF后EGCs的克隆代数高于单独添加LIF，培养效果较好。本研究在培养液中添加LIF+SCF，与单独添加LIF比较，对培养效果也没有显著影响（P＞0.05），即使增加这两种因子的浓度，差异也不显著（P＞0.05），这可能是LIF是PGCs生长和维持未分化状态最重要的细胞因子，并不是因子种类越多，浓度越大就会使得PGCs的原代集落增多和传代次数增加。

3.2 不同消化方式对PGCs分离培养的影响 现在大多数采用的是胰酶+EDTA消化再以辅助吹打分离得到PGCs。许新［7］在37℃下，使用0.02%EDTA消化包含PGCs的组织15 min，然后再用吸管轻轻吹打来获得PGCs。李松［4］以0.2%胰酶+0.04%EDTA的消化液综合作用，对分离牛PGCs的效果好。本试验在室温下，以0.125%胰酶+0.02%EDTA消化效果远远好于0.25%胰酶+0.04%EDTA，以0.25%胰酶+0.04%EDTA消化方式消化组织，细胞活率较低，这种消化方式下细胞死亡较多，培养时形成的集落会少，且无法得到传代的集落。以0.125%胰酶+0.02%EDTA来消化组织，再辅以机械吹打便可得到较多的原代集落，细胞活率较高。

3.3 传代方式对集落形成的影响 杨炜峰［3］研究表明，机械法（辅助酶消化法）可以获得较高的山羊PGCs的传代数。本试验采用挑取集落法和胰酶消化法两种方法，结果显示两种传代方法对传代数和新集落形成率没有显著差异（P＞0.05），第一种方法能较好分散开细胞块；第二种方法只要掌握好胰酶的作用浓度和作用的时间，也有利于新集落的形成和传代。在实际操作中，要根据不同的集落生长状况以及各个实验室的条件选择适应的传代方法，或者同时使用几种方法，才能提高传代效率和得到较好的新集落。

3.4 胎龄的影响 用于分离培养PGCs的胎儿的胎龄是有一定限制的，不同胎龄段的胎儿分离培养PGCs的效果也不同。Lee等［8］从25 d山羊胎儿分离得到PGCs，Kuhholzer等［9］用32 d山羊胎儿分离建立了 PGCs系。韩建永等［10］从44 d山羊胎儿生殖嵴中分离得到PGCs。杨炜峰［3］研究结果显示胎儿胎龄大于45 d（冠臀长大于30 mm）的胎儿也可以得到PGCs。本试验由于胎儿全部取自屠宰场，没有系统的白山羊资料记载，所以只能以胎儿冠臀长来进行分类。臀长小于15 mm的胎儿，仅得到1个原代集落，这可能是由于胎龄过小，虽然PGCs分化程度低，越具有多能性，但是其中PGCs含量过少，或者PGCs还未完全迁移至生殖嵴中；冠臀长大于30 mm的胎儿，没有得到原代的克隆集落，这可能是由于胎龄过大，此时生殖嵴已经发育成为性腺，大部分的PGCs转化为性原细胞，从而无法获得集落，在试验过程中还观察到此胎龄段的胎儿组织块不易消化，消化时间太短无法离散组织，消化时间太长又对细胞造成伤害，影响细胞活力。

3.5 其它因素的影响 本试验中PGCs传至第2代后大多数凋亡或者发生分化，无法继续传代。原因可能有以下几个方面：

采集的胎儿全部来自于屠宰场，从屠宰地点收集胎儿运输到实验室耗费的时间比较长，基本上需要8 h，而且在收集样品时，大多数胎儿脱离母体的时间已经较长了，虽然在运输过程中采用低温保存，尽可能地抑制细胞的代谢活动，但到达实验室时胎儿死亡的时间已经较长了，所以部分细胞可能在运输过程中发生死亡，从而导致PGCs形成原代集落较少。

培养基中添加成分的影响。培养基中的血清质量好坏最直接影响到ESCs的培养效果。血清促进细胞增殖的主要原因是：血清中含有大量的营养物质及促进细胞增殖的生长因子。但是血清也含有很多不确定成分，这些成分有可能诱导ESCs分化。在ESCs培养过程中还要选择适宜的血清浓度，过高或者过低都不利于ESCs的克隆和增殖，而且在细胞培养过程中应该一直采用同一厂家和同一批次的血清。近年来有实验室使用KSR培养ESCs，取得了良好的效果。一般培养ESCs细胞在培养基中还需添加L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇、丙酮酸钠、非必需氨基酸、细胞因子、抗生素等成分，由于这些成分和血清一样来自不同的厂家和不同的批次，其纯度也不尽相同，其中也有可能含有对ESCs促进分化的因子，所以这些因素也会对PGCs集落形成和传代造成影响。

4 结论

本试验采用本地白山羊胎儿生殖嵴为材料，以GEF为培养层，在培养液中添加细胞因子，使用0.125%胰酶+0.02%EDTA传代，无论以挑取集落传代还是以胰酶消化传代均能将PGCs传至第2代。

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