灯盏花素对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响

李 芳，李 燕，龚明玉

（1.承德医学院临床医学系2006级，河北承德 067000；2.指导教师）

冠心病是导致人类死亡的主要原因[1]。在急性心肌梗死后,采用溶栓治疗、经皮冠状动脉介入术(PCI)或冠状动脉旁路移植术(CABG)以早期恢复心肌再灌注是缩小梗死范围和改善临床转归的最有效方法。但动物模型研究提示,致死性再灌注损伤最多可占心肌梗死最终体积的50%[2]。研究发现,灯盏花素具有扩张血管、降低血液黏滞度、改善微循环、防治血栓形成的作用,可有效地预防氯化钡、肾上腺素过量所导致的心律失常[3]。本研究通过用大鼠在体心脏模拟临床缺血再灌注损伤病理变化,旨在观察灯盏花素是否具有抗细胞凋亡等保护心肌的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）试剂：灯盏花素注射液（吉林龙泰制药股份有限公司），TUNEL检测试剂盒（Roche公司）。（2）动物：健康SD大鼠40只，体重220±20g，雌雄各半（购自天津市山川红实验动物科技有限公司，许可证号scxk津2009-001）。

1.2 方法

1.2.1 实验动物的分组及处理：40只SD大鼠随机分为4组：正常对照组、缺血再灌注组、灯盏花素I组和灯盏花素II组，每组10只。4组大鼠均制备心肌缺血再灌注模型，其中灯盏花素2个组大鼠于手术前1周分别腹腔注射不同剂量的灯盏花素（25mg.kg-1.d-1、50mg.kg-1.d-1），连用7d；正常对照组和缺血再灌注组术前分别给予相应容积的生理盐水，时间同灯盏花素组。

1.2.2 心肌缺血再灌注模型的制备:10%乌拉坦腹腔注射麻醉（1ml.100g-1）大鼠，仰卧位固定，用针型电极插入大鼠四肢皮下记录标准肢体II导联心电图。于胸骨左缘3-4肋间切开胸壁，暴露心脏，在左心耳与肺动脉干之间结扎左冠状动脉前降支，同时在结扎线与血管之间穿一直径2mm，长5mm的硅胶管，结扎30min；然后剪断缝合线，取出硅胶管，再灌注2h。假手术组仅分离前降支，但不结扎。

1.2.3 心肌细胞凋亡的TUNEL染色:(1)按照试剂盒说明书操作如下：石蜡切片常规脱蜡至水，新配置的3%H2O2溶液室温放置10min,以封闭内源性过氧化物酶（POD）,蛋白酶K(25μg/ml)37℃消化30min，加TUNEL混合液，湿盒37℃，60min，加ulcon-POD，37℃，30min，DAB显色，苏木精复染，中性树胶封片。标记前用DNA酶处理切片做阳性对照，用标记液代替TUNEL反应液做阴性对照。(2)检测内容：阳性细胞核和（或）细胞碎片呈深浅不一的棕黄色，每张切片随机选取10个视野（×400倍），记数凋亡阳性细胞，以凋亡指数（apoptosisindex,AI）做为凋亡程度的指标。AI=(视野内凋亡细胞个数/视野内所有细胞个数)×100%

2 结果

灯盏花素对缺血再灌注大鼠心肌细胞凋亡的影响:TUNEL染色阳性产物位于细胞核，呈棕黄色颗粒状。IR组的AI显著大于control组（P＜0.01）；breI、II组的AI小于IR组（P＜0.05，P＜0.01），说明灯盏花素可以抑制缺血再灌注诱导的心肌细胞凋亡见附表与图1-4。

附表 各组大鼠心肌细胞凋亡指数比较（n=10，±S）

附表 各组大鼠心肌细胞凋亡指数比较（n=10，±S）

与假手术组比较*P＜0.01；与模型组比较▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

组别 给药剂量（mg .kg-1.d-1）AI正常对照组 - 4.24±0.96缺血再灌注组 - 15.78±2.09*灯盏花素I组 25 13.97±1.98▲灯盏花素II组 50 10.55±1.27▲▲

3 讨论

近些年来,减轻心肌缺血再灌注损伤一直是心脏病学应用基础研究中的一个热点。研究发现,心肌缺血再灌注过程可诱导细胞凋亡,细胞凋亡是MIRI的特征之一,并且与心肌迟发性死亡关系密切,细胞凋亡的多少决定着IR损伤的轻重[4、5]。冯全洲等[6]在大鼠实验性心肌缺血后可引起细胞凋亡；赵明中等[7]在大鼠心肌缺血/再灌注时发现心肌细胞凋亡。细胞凋亡是受基因调控有序的细胞非炎症性死亡,药物预处理干预心肌细胞凋亡被认为是预防和治疗再灌注损伤的一条新途径[8]。灯盏花素是从中药灯盏花中分离得到的黄酮类化合物,现代药理研究表明灯盏花素具有扩张血管、改善微循环、抗凋亡等作用[9]。本研究结果显示，与正常对照组相比，缺血再灌注组的心肌细胞凋亡指数明显增加（P＜0.01）,灯盏花素组的心肌细胞凋亡指数较缺血再灌注组明显降低（P＜0.05，P＜0.01）。

根据以上实验结果，提示灯盏花素可以抑制再灌注心肌细胞的凋亡而具有心肌细胞的保护作用,其作用机制可能是通过下调Caspase-3蛋白的表达来实现的。

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