终末糖基化产物、高脂诱导内皮细胞凋亡的作用途径及葛根素的保护作用*

张 洁，郭茂娟，薛 亮，范英昌

细胞凋亡进程中重要的执行者和与细胞凋亡进程密切相关的线粒体属于细胞凋亡的信号转导范畴。Caspase家族作为特异性的死亡信号传导分子是凋亡的执行者，Caspase-3作为凋亡级联中的效应因子被称为“杀手蛋白”。如果高糖高脂促进凋亡，则进一步信号转导途径的改变以明确凋亡的机制[1]。本实验探讨葛根素对血管内皮细胞的影响，研究葛根素在动脉粥样硬化（AS）发生发展中的多靶点调控作用[2-3]。首先通过终末糖基化产物（AGE）和氧化低密度脂蛋白（ox－LDL）干预离体培养胎儿脐静脉内皮细胞，从内皮细胞凋亡剥脱入手，离体探讨糖尿病与斑块糜烂的相关性，明晰斑块糜烂的发病机制；其次选择有效保护内皮细胞的中药葛根素作为研究对象，观察其稳定斑块的作用及相应机制，为合并高糖的动脉粥样硬化患者防治提供实验依据，开拓稳定斑块的新思路。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器 葛根素由协和医科大学药物研究所提供，AGES购自博奥森试剂公司，氧化低密度脂蛋白（ox－LDL）购自北京中医研究院，DMEM购自GIBCO公司，胎牛血清购自Hyclone公司，人脐静脉内皮细胞株ECV－304购于天津血液病研究所。Caspase3试剂盒购自Santa Cruz公司，CD31单克隆抗体（1∶100 Sigma）购置天津市联星生物制剂有限；流式细胞分析仪（BD），病理图像分析系统。

1.2 细胞培养 采用人脐静脉内皮细胞分离培养方法。无菌条件下取健康产妇脐带,用Hanks缓冲液反复冲洗后,加入1%胶原酶，37℃消化15 min后终止，离心后加入完全培养液DMEM（5%小牛血清，1×105U/L青霉素，1×105U/L链霉素),置于 37℃、5%CO2孵箱中培养，24 h后换液，待细胞80%融合，用胰蛋白酶－EDTA消化传代，经CD31鉴定后，第2~3代用于实验。

1.3 高糖高脂干预剂量及药物浓度的确定

1.3.1 高糖浓度确定 用不同浓度（12.5，25，50，100，200 μg/mol）AGE 与内皮细胞共同孵育 24 h，噻唑蓝（MTT）法测存活细胞数，绘制抑制率曲线，以确定最佳浓度，最终确定50 μg/mol为最佳浓度。

1.3.2 高脂浓度确定 用不同浓度（0、25、50、100、200 mg/L)的ox-LDL与内皮细胞共同孵育24 h，MTT法测存活细胞数，绘制抑制率曲线，确定最佳浓度，最终确定50 mg/L为最佳浓度。

1.3.3 药物浓度设定 根据前期的实验结果，葛根素与内皮细胞孵育2 h后加入高糖高脂，共同孵育24 h。MTT法测存活细胞数，绘制抑制率曲线，确定最佳浓度，葛根素的最佳浓度是100 mg/L，洛伐他汀药浓度为2 g/L，有效浓度为50 μmol/L。

1.4 实验分组 1）正常组：正常培养基培养细胞，不作任何处理。2）高糖加高脂（AGE+ox-LDL组）：正常培养基培养细胞，并用高糖高脂进行干预。3）阳性对照药组（AGE+ox-LDL组+洛伐他汀组）：在2）基础上，用洛伐他汀干预。4）AGE+ox-LDL+葛根素组：在2）基础上，用葛根素进行干预。

1.5 方法

1.5.1 采用相应的活性Caspase3抗体免疫细胞化学法检测 生长良好的EVC304经消化后，接种于放有盖玻片的6孔培养板，培养过夜，待细胞长致八成满。在处理因素作用48 h后，取出附有内皮细胞的盖玻片，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗3遍，0.4 g/L多聚甲醛固定，按SABC免疫酶标试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）方法进行。每张片子按照从上倒下，从左到有顺序选取8个视野，计数Caspase3阳性细胞数，求得平均值作为该张片子的平均阳性细胞数。

1.5.2 流式细胞仪定量检测凋亡细胞率 实验用六孔培养板,1×106/孔,收集各组细胞加入罗丹明123染液 5 mg/L，37℃，5%二氧化碳（CO2）细胞培养箱孵育10 min，离心以培养基洗细胞两次，重悬细胞于培养基中，37℃，5%CO2培养60 min，流式细胞仪检测：激发波长488～505nm，发射波长515～575 nm（一般为530nm）；MedFitLT3.0软件分析细胞凋亡百分率。

1.6 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件。结果用均数±标准差（s）表示，经检验数据成正态分布，则采用单因素方差分析，以P＜0.05为有统计学差异。

图1 内皮细胞FITC标记CD31×200

2 结果

2.1 CD31鉴定内皮细胞 见图1。

培养的血管内皮细胞CD31FITC标记的免疫荧光，在荧光显微镜下观察：胞浆染色显示绿色，中间的核不着色，证实为内皮细胞。

2.2 免疫细胞化学法检测Caspase3凋亡细胞数 葛根素处理人脐静脉EVC304 48 h，Caspase3阳性细胞数与对照组明显降低，内皮细胞中呈现棕褐色颗粒者为阳性细胞。见表1。

2.3 流式细胞仪检测各组凋亡百分比 与正常组相比,高糖高脂培36 h后明显增加内皮细胞凋亡率,而葛根素预处理12 h后加入高糖作用36 h,凋亡率明显下降。见表2。

表1 各组细胞Caspase3阳性细胞数（s）个

表1 各组细胞Caspase3阳性细胞数（s）个

注：与正常组比较，aP<0.01；与 AGES ＋OX－LDL 组比，bP＜0.05，AGES＋OX－LDL＋洛组与 AGES＋OX－LDL＋葛组相比，没有统计学差异 P＞0.05。

组别正常组AGES+OX-LDL AGES+OX-LDL+洛AGES+OX-LDL+葛n8888 caspase3阳性细胞数3.375±1.59 22.375±9.22a 15.625±4.89b 15.375±4.47

表2 流式细胞仪检测各组细胞凋亡百分率（s）%

表2 流式细胞仪检测各组细胞凋亡百分率（s）%

注：与正常组比较，aP＜0.01；与 AGES ＋OX－LDL 组比，bP＜0.01，cP＜0.05，与 AGES＋OX－LDL＋洛组比。

组别正常组AGES+OX-LDL AGES+OX-LDL+洛AGES+OX-LDL+葛n8888凋亡率4.46±0.44 6.10±0.36a 2.40±0.12 1.10±0.55c

3 讨论

血糖升高是糖尿病大血管并发症的危险因素[4]，高糖可以导致多种形式的血管内皮细胞功能失调，其中内皮细胞凋亡被认为与糖尿病相关的动脉粥样硬化加重有关[5]。本实验证明在高糖环境下葛根素具有抗内皮细胞凋亡的作用，并减弱高糖诱导的凋亡相关蛋白Caspase-3活性。细胞凋亡是受细胞内源性基因、酶和信号传导途径调控的一个“瀑布式”激活过程。近年人们发现了一类在细胞凋亡的信息传递中具有重要作用的蛋白酶家族Caspase，目前已发现该家族中有16个成员，Caspase3则是这一家族的重要成员，它处于细胞凋亡过程中的关键地位[6]。Caspase3被激活后可裂解产生相对分子质量1.7万的活性亚单位，后者可进一步激活Caspases活化的核酸内切酶（CAD），活化的CAD可切割DNA，导致细胞发生凋亡，在多种细胞的凋亡过程中均有Caspase3的活性的变化[7-8]。

实验通过免疫组化的方法，检测凋亡细胞数，结果显示,在凋亡率最高的模型组中，Caspase3阳性细胞数最高，正常组Caspase3最低，说明Caspase3能够直接反映细胞凋亡情况，跟凋亡密切相关。经过用药干预，各治疗组Caspase3阳性细胞数均明显下降，细胞凋亡趋势减弱，葛根素与阳性对照组Caspase3阳性细胞数比较，没有统计学差异P>0.05。说明葛根素可通过抑制Caspase3的表达，减少内皮细胞的凋亡。

实验采用流式细胞仪分析检测凋亡百分比。结果发现：高糖高脂可以诱导人脐静脉血管内皮细胞凋亡，而且进一步证明葛根素预处理后可以抑制高糖高脂诱导的内皮细胞凋亡,葛根素组和洛伐他汀作为阳性对照组内皮细胞凋亡均有明显低于模型组（P<0.05），且葛根素组效果更好，说明葛根素能够抑制高糖高脂环境下的内皮细胞凋亡。

最近研究表明葛根素由于其主要成分异黄酮具有雌激素样作用，因此又被归为植物雌激素。植物雌激素可以结合于雌激素受体发挥雌激素样作用，可以预防某些癌症的发生、抗氧化、清除氧自由基、降低血清胆固醇、促进细胞增殖。其对抗缺血缺氧、氧自由基过多性内皮细胞凋亡的作用，有利于维持血管内皮细胞的屏障功能和内分泌功能，可以减轻缺血后炎症反应[3]，对预防临床溶栓或血管介入治疗中常出现的缺血/再灌注损伤具有积极意义。研究表明，葛根素对内皮细胞有保护作用，为临床治疗提供了理论依据。

[1]Durand E,Scoazec A,A Lafont J,et al.Thrombotic In Vivo Induction of Endothelial Apoptosis Leads to Vessel Thrombosis and Endothelial Denudation:A Clue to the Understanding of the Mechanisms of Thrombotic Plaque Erosion[J].Circulation，2004,109:2503-2506.

[2]范英昌,李 妍,赵福梅.葛根素对同型半胱氨酸损伤内皮细胞的影响[J].中国老年病学杂志,2006,26（3）:372-373.

[3]王永霞,何立人.葛根素的心血管系统药理作用及机理研究[J].上海中医药杂志,2004:27(4):62-64.

[4]卢雪玲,谢自敬,王 宁,等.2型糖尿病患者动脉粥样硬化若干危险因素分析[J].中国动脉硬化杂志,2006,14(5):426-429.

[5]Piconi L,Quagliaro L,Assaloni R,et al.Constant and intermittent high glucose enhances endothelial cell apoptosis throughmitochondrial superoxide overproduction[J].Diabetes－MetalResRev,2006,22(3):198-203.

[6]郭 芳,何 慧,孙文清,等.MG132诱导人血管平滑肌细胞凋亡及对caspase3表达的影响[J].中国药物与临床,2009,9（5）:381-384.

[7]刘希双,侯仁好,初晓艺.Bcl-2与Caspase-3蛋白在胃癌中的表达及其意义[J].青岛大学医学院学报,2005,41(3):232-234.

[8]宋 莉,宋 扬.IP6对人结肠癌细胞HT-29凋亡Caspase3 基因作用[J].青岛大学医学院学报,2008,44（3）：201-204.