不同方法除鞣质后贯叶金丝桃提取物中金丝桃素的含量变化*

李前琼 ，王金林 ，王晓利 ，张俊松 ，张德志

（1.深圳职业技术学院，广东 深圳 518055； 2.广东药学院，广东 广州 510006）

贯叶金丝桃 Hypericum performatum L.又名贯叶连翘、圣约翰草，为藤黄科金丝桃属植物，具有清热解毒、抗菌消炎、消肿止血、利湿止痛等功效[1]。研究证明，贯叶金丝桃主要活性成分金丝桃素（hypericin，HY）具有抗抑郁、抗病毒、抗肿瘤等作用[2-4]。在医药工业和临床上目前应用的主要是贯叶金丝桃的提取物，但其中还含有鞣质、有机酸、挥发油等杂质成分，其中鞣质质量分数高达10%[5]。鞣质又称单宁或植物单宁，是一类广泛存在于植物体内且结构复杂的多元酚化合物，可溶于水、乙醇、丙酮等，高含量的鞣质会对后续分离纯化HY带来困难。本试验考察了不同方法除去贯叶金丝桃提取物中的鞣质，并利用高效液相色谱（HPLC）法测定除鞣质后HY含量的变化和收率。

1 仪器与试药

岛津LC-20A高效液相色谱仪，包括SPD-M20A二极管阵列检测器，LC-20AT输液单元，CBM-20Alite系统控制器，岛津LC-20A配套处理软件LC-solution；KQ2200DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Sartorious万分之一电子天平。金丝桃素对照品（瑞士Alexis Biochemicals公司，纯度为99.2%，批号为L15535/a）；贯叶金丝桃提取物（常州神马植物提取有限公司）；明胶（广东环凯生物科技有限公司）；甲醇为色谱纯（天津协和昊鹏色谱科技有限公司）；乙醇为分析纯（台山市粤侨试剂塑料有限公司）；水为超纯水；其余试剂为国产分析纯。

2 方法与结果

2.1 HY含量测定

2.1.1 色谱条件[6]

色谱柱：Phenomenex-C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.006 mol/L Na2HPO4（7∶1，V/V，H3PO4调pH=6.5）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：590 nm；进样量：10 μL。

2.1.2 溶液制备

精密称取贯叶金丝桃提取物0.5 g，置10 mL棕色量瓶中，以色谱纯甲醇超声溶解后定容，作为供试品溶液。精密称取金丝桃素对照品0.97 mg，置5 mL棕色量瓶中，色谱纯甲醇超声溶解后定容，精密吸取1 mL，置10 mL棕色量瓶中定容，配制成质量浓度为0.019 4 mg/mL的对照品溶液。

2.1.3 方法学考察

标准曲线绘制：精密吸取对照品溶液，分别进样1，5，10，15，20，25 μL，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积对HY进样量作线性回归，回归方程为 Y=2 722 400.781X-6 184.994，r=0.999 9（n=6）。结果表明 HY进样量在0.019 4～0.776 0 μg范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取对照品溶液，连续进样5次，测定峰面积。结果峰面积的 RSD为0.041%（n=5），表明方法精密度良好。

重现性试验：分别精密称取同一批次样品0.5 g，依法制备供试品溶液并测定。结果HY的平均含量为0.088%，RSD为0.067%（n=6），表明方法重现性良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，于 0，2.5，5.0，7.5，10 h 时依法测定。结果的 RSD为0.16%（n=5），表明供试品溶液在10 h内稳定性良好。

加样回收试验：精密吸取供试品溶液5份，各500 μL，分别精密加入0.019 4 mg/mL的对照品溶液500 μL，混匀后依法测定含量，计算回收率。结果见表1。

表1 HY加样回收试验结果 （n=5）

2.2 未除鞣质提取液制备

精密称取贯叶金丝桃提取物2 g，置具塞锥形瓶中，加入60%乙醇20 mL，密塞后超声处理40 min，取出冷却至室温，过滤，滤液定容于50 mL量瓶中，0.45 μm滤膜过滤，以HPLC法测定HY含量，计算出贯叶金丝桃提取物中HY含量。

2.3 不同方法除鞣质提取液制备

明胶沉淀法：精密称取贯叶金丝桃提取物2 g，置具塞锥形瓶中，加入60%乙醇20 mL，密塞后超声处理40 min，取出冷却至室温。加入10%明胶溶液5 mL（慢加快摇），静置片刻后滤去沉淀，调乙醇质量分数至75%以除去过量明胶，过滤，滤液定容于50 mL量瓶中，0.45 μm 滤膜过滤，HPLC法测除鞣质提取液中HY含量。减压挥去溶剂后，测定除鞣质后贯叶金丝桃提取物固形物质量，计算HY的含量和收率。

改良明胶沉淀法：加入10%明胶溶液5 mL（慢加快摇）前的操作同明胶沉淀法，静置片刻，调乙醇质量分数至75%，4℃冷藏过夜，过滤，滤液定容于50 mL量瓶中，后续操作同明胶沉淀法。

碱性醇沉法：密塞后超声处理40 min前的操作同明胶沉淀法，取出冷却至室温，调乙醇质量分数至80%后，用1 mol/L氢氧化钠溶液调节至pH=8，4℃冷藏过夜，过滤，滤液定容于50 mL容量瓶中，后续操作同明胶沉淀法。

2.4 除鞣效果检测

分别取2.3项下各除鞣液1 mL，滴加10%明胶溶液1 mL，根据药液浑浊程度检验除鞣效果。结果明胶沉淀法和改良明胶沉淀法能完全去除鞣质，在除鞣提取液中滴加明胶溶液未出现混浊，溶液澄明；而碱性醇沉法除鞣液加明胶溶液后则出现少许混浊，说明除鞣不完全。

2.5 样品含量和收率测定

分别取贯叶金丝桃提取物除鞣前后的样品液，在2.1.1项下色谱条件下测定，以外标法计算HY含量和收率，结果见表2。可见明胶沉淀法除鞣质后提取物固形物质量降低较多，虽除鞣完全，但除鞣后HY损失较大，收率较低；碱性醇沉法除鞣质，HY收率虽较高，但除鞣不完全；改良明胶沉淀法除鞣质HY损失较少，纯度有所提高，且鞣质去除完全，可以有效减少后续分离纯化色谱填料对鞣质的死吸附，有利于填料再生，减少废料产生和环境污染。

表2 3种方法HY含量变化和收率比较（n=3）

3 讨论

获得高纯度的HY是当前世界植物药市场的研究热点之一，但贯叶金丝桃中大量存在的鞣质，为后续分离纯化带来困难。不同方法除鞣质后对贯叶金丝桃提取物中活性成分HY含量和收率的影响尚未见报道。本试验建立了改良明胶沉淀除鞣法，其HY含量和收率较高，且简便易行、重现性好，可供植物活性成分纯化工艺的研究和改进参考。

[1]李 艳，曹学丽，付 鹏，等.贯叶金丝桃活性成分及其分离纯化与检测方法的研究进展[J].药学进展，2008，32（1）：15.

[2]胡 然，库宝善，张永鹤.人类免疫缺陷病毒与疱疹病毒感染具有相关性[J]. 生理科学进展，2004，35（1）：63-65.

[3]杨得坡，甘良春，胡海燕.国外对贯叶连翘抗抑郁疗效的临床验证[J].中西医结合学报，2004，2（3）：231-238.

[4]施正福，范 焱.贯叶金丝桃的药理作用研究进展[J].中国现代应用药学杂志，2000，17（3）：190-193.

[5]李 莹，禹玉洪，杨书良，等.贯叶连翘的提取与除鞣工艺研究[J].哈尔滨商业大学学报，2006，22（2）：13.

[6]张俊松，王晓利，罗 谦，等.不同产地贯叶金丝桃中金丝桃素和伪金丝桃素的含量分析[J].中国药业，2006，15（12）：11.