高效液相色谱法测定心脉神胶囊中大黄素含量

曹 健，黄林清，王 芳，朱丽莎，张恩娟

（1.第三军医大学新桥医院药学部，重庆 400037； 2.重庆医科大学药学系，重庆 400016）

心脉神胶囊是我院研制的非标制剂，由何首乌、黄芪、赤芍等中药组成，临床应用于冠状动脉粥样硬化性心脏病的治疗，对急性心肌梗死恢复期、心绞痛的防治及缺血性心肌病等，疗效较好。大黄素为何首乌的主要有效成分之一，具有凉血解毒、逐瘀通经的功效。笔者选用高效液相色谱（HPLC）法测定了心脉神胶囊中大黄素的含量，现报道如下。

1 仪器与试药

Waters 600型高效液相色谱仪（美国Waters公司），紫外检测器；ME 235 s型电子天平（德国Sartorius）；电热恒温水浴锅（上海医疗器械五厂）；CSF-1A型超声波发生器（上海超声波仪器厂）；CS202A型电热保温干燥箱（重庆实验设备厂）；RE-52A型旋转蒸发仪（上海亚索生化仪器厂）。大黄素对照品（中国药品生物制品检定所，批号为0714-9903）；心脉神胶囊（第三军医大学新桥医院自制，规格为 0.45 g/粒，批号分别为 070806，080325，080729）；阴性对照样品（缺何首乌）为本院自制。甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Hypersil ODS 柱（150 mm ×4.6 mm，10 μm）；流动相：甲醇 -0.02 mol/L 磷酸 （75 ∶25）；流速：1.2 mL/min；检测波长：438 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液制备

精密称取大黄素对照品5.5 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇振摇使溶解，定容至刻度，即得对照品溶液。精密称取心脉神胶囊内容物5 g，加50 mL无水乙醇，在85℃下回流1 h，过滤，滤液于65℃旋转蒸发仪上蒸干，加甲醇溶解乙醇提取物，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，微孔滤膜（0.45 μm）滤过，即得供试品溶液。精密称取阴性对照样品胶囊内容物5 g，按照供试品溶液制备方法制备缺何首乌的阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

系统适用性试验：将对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液3种溶液分别进样10 μL，高效液相色谱图见图1。可见阴性对照品溶液对大黄素的含量测定无干扰。

标准曲线绘制：精密量取对照品溶液 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，分别置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取10 μL注入高效液相色谱仪测定。以峰面积（A）对质量浓度（C）进行线性回归，得回归方程 A=33 111 090.9 C+396.4，r=0.999 8（n=5）。结果表明，大黄素质量浓度在0.002 2～0.011 0 g/L范围内与峰面积呈良好的线性关系。

精密度试验：精密量取对照品溶液1.0 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，连续进样10 μL，测定5次，记录色谱图，测定大黄素对照品峰峰面积。结果平均峰面积为216 563，RSD=1.25%（n=5），表明仪器精密度良好。

重现性试验：取同一批供试品5份，按供试品溶液制备方法制备，进样测定。结果大黄素平均峰面积为207 207.2，RSD=2.5%（n=5）。

稳定性试验：精密吸取同一供试品溶液10 μL，于0，5，24 h时进样，记录每次进样的峰面积。结果大黄素平均峰面积分别为213 614，213 280，214 478，RSD=0.29%（n=3），表明供试品溶液在 24 h 内基本稳定。

加样回收试验：精密称取已知含量的心脉神胶囊内容物2.0 g，共3份，按供试品溶液制备方法制备，分别加入一定量的大黄素对照品溶液（0.11 g/L）0.5，1.0，1.5 mL，平行操作 5 次，依法测定。结果见表1。

2.4 样品含量测定

取3批样品，按照供试品溶液制备方法制备样品溶液。分别精密吸取对照品溶液和样品溶液各10 μL进样，测定峰面积，计算大黄素的含量。结果批号为070806，080325，080729的3批样品中，大黄素平均含量分别为 0.012 7，0.014 1，0.016 8 mg/粒（n=5）。

表1 加样回收试验结果

3 讨论

有文献报道，将大黄素的甲醇溶液置紫外-可见光分光光度计扫描，结果大黄素在438，290，253，220 nm波长处均有吸收峰[1-2]，试验证实438 nm作为检测波长时杂质干扰较少，故采用438 nm作为检测波长。

该制剂中何首乌以水煎提取后投料，所含蒽醌类化合物可溶于甲醇、乙醇、氯仿等有机溶剂[3]。若采用氯仿作为溶剂提取大黄素，在本试验条件下检测不到大黄素的色谱峰，若用无水乙醇作溶剂则既可减少水溶性杂质的干扰，又可充分提取大黄素。故采用无水乙醇作为溶剂提取大黄素。

大黄素可以通过回流[4]和甲醇超声的方法来提取[5]。笔者对所考察几个批号的胶囊做了两种提取方法的对比试验，取相同量的胶囊内容物分别同时进行无水乙醇回流和甲醇超声（250 mA），时间均为1 h，此后的操作方法相同。结果采用甲醇超声提取的大黄素含量仅为无水乙醇回流提取的30%～60%。故采用无水乙醇回流提取心脉神胶囊中的大黄素。

本文中3个批次的胶囊中大黄素含量有较大差异。由文献[6]可知，受产地、生长年限、采收季节等因素影响，大黄素含量差异较大，西南地区何首乌药材中大黄素的含量为0.004% ～0.41%。根据心脉神胶囊中何首乌的用量并结合制备工艺的影响，拟订心脉神胶囊中大黄素的最低限量为0.012 mg/粒。

[1]丁贤贵，刘丽娜，李勇军，等.反相高效液相色谱法测定心脑联通胶囊中大黄素的含量[J]. 贵阳医学院学报，2005，30（3）：232-234.

[2]罗金树，谭永恒.HPLC法测定芩黄喉症胶囊中大黄素的含量[J].中药新药与临床药理，2006，17（3）：224-226.

[3]肖崇厚，杨松松，丁林生，等.中药化学[M].上海：上海科学技术出版社，2004：205-206.

[4]瞿发林，谈丽娜，赵 勇.复方夜灵胶囊中大黄素的含量测定[J].中国药师，2006，9（12）：1 127-1 129.

[5]刘玉红，王 妮.HPLC测定大败毒胶囊中大黄素的含量[J].中医药学刊，2006，24（5）：936-938.

[6]张 韵，劳三申，唐青华.西南地区何首乌原药材的质量分析[J].中成药，1999，21（6）：317-319.