接骨康合剂的质量标准研究

夏德豪，胡 剑

（湖南省邵阳市药品检验所，湖南 邵阳 422001）

接骨康合剂为邵阳市中西医结合医院自制的医院制剂，处方由大黄、青皮、当归、红花、地龙等10味药材组成，具有行气、行血、化瘀止痛、接骨续筋的功效，用于治疗外伤淤血、扭伤、筋韧之伤、骨折初期等，经多年临床验证，疗效确切。为了有效地控制制剂质量，本试验采用薄层色谱（TLC）法对制剂中的大黄、青皮、当归进行定性鉴别，采用高效液相色谱（HPLC）法对大黄中的大黄素进行含量测定，报道如下。

1 仪器与试药

Waters高效液相色谱仪，包括1525泵、2996紫外检测器、1500柱温箱、717自动进样器；AG-135型电子天平（梅特勒-托利多〈上海〉有限公司）。大黄素对照品（批号为110756-200512，供含量测定用）、大黄对照药材（批号为120984-200602）、青皮对照药材（批号为121155-200502）、当归对照药材（批号为120927-200613）均购自中国药品生物制品检定所；接骨康合剂（邵阳市中西医结合医院自制）；硅胶G（青岛海洋化工厂）；甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 TLC鉴别

大黄：取样品20 mL，用乙酸乙酯振摇提取3次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，将乙酸乙酯液蒸干，加水30 mL使溶解，用2%氢氧化钠溶液振摇提取3次，每次20 mL，合并氢氧化钠溶液，用浓盐酸酸化后，用乙酸乙酯振摇提取3次，每次20 mL，合并乙醚液，乙醚液蒸干，残渣加乙醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。取去大黄的其他处方量药材，按制备工艺方法制成阴性样品，取20 mL同法制成阴性对照品溶液。另取大黄对照药材1 g，加甲醇10 mL，超声处理20 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为对照药材溶液。照TLC法[2005年版《中国药典（一部）》附录ⅥB]试验，吸取上述3种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶H薄层板上，以石油醚（30～60℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶4∶1）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置碘蒸气中薰约5 min，取出，待碘挥尽后，置可见光灯下检视。结果供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照品溶液无干扰（图1 A）。

青皮：取样品20 mL，用乙酸乙酯20 mL振摇提取，乙酸乙酯提取液蒸干，残渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作为供试品溶液。取去青皮的其他处方量药材，按制备工艺方法制成阴性样品，取20 mL同法制成阴性对照品溶液。另取青皮对照药材1 g，加水50 mL煎煮20 min，滤过，滤液用乙酸乙酯20 mL同上法操作，作为对照药材溶液。照TLC法[2005年版《中国药典（一部）》附录ⅥB]试验，吸取上述3种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯（10∶6）为展开剂[1]，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的荧光斑点，阴性对照品溶液无干扰（图1 B）。

当归：取样品20 mL，用乙醚提取3次，每次20 mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加乙酸乙酯2 mL使溶解，作为供试品溶液。取去当归的其他处方量药材，按制备工艺方法制成阴性样品，取20 mL同法制成阴性对照品溶液。另取当归对照药材1 g，加乙醚10 mL，超声处理10 min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作为对照药材溶液。照TLC法[2005年版《中国药典（一部）》附录ⅥB]试验，吸取上述3种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯（4∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的荧光斑点，阴性对照品溶液无干扰（图 1 C）。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil C18柱 （250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇 -0.2% 磷酸（75 ∶25）[2]；检测波长：254 nm；柱温：35 ℃ ；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL。

2.2.2 溶液制备

精密称取大黄素对照品10.23 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取20 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液（质量浓度为10.23 μg/mL）。精密吸取样品10 mL，置具塞锥形瓶中，精密加入三氯甲烷50 mL和10%盐酸溶液10 mL，密塞，称定质量，加热回流2 h，放冷，称定质量，用三氯甲烷补足减失的质量，摇匀，分取三氯甲烷液，精密量取20 mL，减压回收至干，残渣加甲醇使溶解，转移至10 mL量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。取除大黄外的其他处方量药材，按制备工艺方法制备阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

系统适用性试验与阴性干扰试验：分别精密吸取对照品溶液、阴性对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按拟订的色谱条件测定。结果大黄素与其他组分色谱峰可达基线分离，且与相邻色谱峰分离度大于1.5，理论塔板数按大黄素峰计均在3 000以上，表明色谱行为良好。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱峰相应的位置上检出色谱峰，而阴性对照品溶液在与对照品溶液色谱峰相应的位置无色谱峰，说明阴性样品对测定无干扰（见图 2）。

线性关系考察：分别精密吸取质量浓度为10.23 μg/mL的大黄素对照品溶液 1，3，6，12，20，25 μL，注入液相色谱仪，按拟订的色谱条件测定峰面积积分值，以对照品质量浓度为横坐标、峰面积积分值为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程 A=2.43 × 106C+1 683.15，r=1.000 0（n=6）。结果表明大黄素进样量在0.010 23～0.204 6 μg范围内与峰面积积分值具有良好的线性关系。

精密度试验：取同一质量浓度的大黄素对照品溶液，在拟订的色谱条件下测定，连续进样5次。结果峰面积积分平均值为235 128，RSD=1.67%（n=5）。表明方法精密度良好。

稳定性试验:分别精密吸取同一供试品溶液10 μL，于0，2，4，8，16，24 h时进样。结果大黄素峰面积积分平均值为231 287，RSD=0.63%（n=6）。表明供试品溶液在24 h内稳定。

重现性试验：取同一样品（批号为080901）5份，按拟订的含量测定方法测定。结果大黄素平均含量为23.386 μg/mL，RSD=1.05%（n=5），表明方法重现性良好。

加样回收试验：分别精密量取对照品溶液（0.041 39 mg/mL）2.4，2.4，2.4，3.0，3.0，3.0，3.6，3.6，3.6 mL，置具塞锥形瓶中蒸干，各精密加入已知含量的供试品溶液5 mL（批号为080901，含量为23.386 μg/mL）和水5 mL，依法测定大黄素含量，计算回收率。结果见表1。

表1 大黄素加样回收试验结果（n=9）

2.2.4 样品含量测定

分别取对照品溶液和供试品溶液各10 μL进样，记录色谱图，按外标法计算大黄素含量。结果批号为080901，080902，080903的样品中大黄素平均含量为 23.39，31.56，29.53 μg/mL（ n=3）。

3 讨论

方中大黄为君药，其主要有效成分为大黄素、大黄酸、大黄酚等蒽醌类化合物，而测定大黄素含量的HPLC法较成熟，故选择大黄中的大黄素作为含量测定对象。

方中干扰成分多，而青皮TLC鉴别的显色方法按文献[2]在紫外光灯365 nm下检视，只有1个斑点，且不清晰。试验中改用10%硫酸乙醇溶液显色，在105℃加热后，置紫外光灯（365 nm）下检视，专属性斑点增加至3个，且斑点清晰，分离效果好。

本方法薄层色谱和含量测定的阴性均无干扰，制剂质量基本稳定，为制剂质量控制提供了有效的分析方法，且方法简单，专属性强、重现性好，精密度、回收率都较满意，因此可作为接骨康合剂的质量控制方法。

[1]苗明三，李振国.现代实用中药质量控制技术[M].北京：人民卫生出版社，2000：603.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：化学工业出版社，2005：17.