阿魏酸钠对博来霉素肺纤维化大鼠肺组织TGFβRmRNA表达的影响

穆茂 程德云 聂莉 杨礼腾 胡晓波 方询 陈文彬

阿魏酸钠对博来霉素肺纤维化大鼠肺组织TGFβRmRNA表达的影响

穆茂 程德云 聂莉 杨礼腾 胡晓波 方询 陈文彬

目的 观察阿魏酸钠对肺纤维化大鼠肺组织TGFβRⅡmRNA表达的影响，探讨其治疗肺纤维化的作用及机制。方法 将30只SD大鼠随机分为对照组，肺纤维化模型组和阿魏酸钠治疗组，每组10只。模型组和治疗组以气管内滴入博来霉素(5mg/kg)建立肺纤维化动物模型，治疗组采用阿魏酸钠(150mg/kg体重)灌胃治疗。HE染色检测肺组织病理改变，免疫组化检测Ⅰ型胶原纤维，原位杂交检测转化生长因子β受体ⅡmRNA(TGFβRⅡmRNA)。结果 与对照组比较，肺纤维化模型组肺组织Ⅰ型胶原纤维显著增加(P＜0.001)。阿魏酸钠治疗组与肺纤维化模型组比较，肺组织内1型胶原纤维表达减弱(P＜0.001)，TGFβRⅡmRNA表达降低(P＜0.05)。结论 阿魏酸钠能有效地减轻肺纤维化大鼠肺组织的纤维化程度，其机制可能与其抑制肺内TGFβRⅡmRNA的表达，从而阻止Ⅰ型胶原过度沉积有关。

阿魏酸钠；肺纤维化；1型胶原纤维；转化生长因子βⅡ受体

肺纤维化主要的发病机制是复杂的细胞因子网络调控失衡导致胶原纤维代谢失衡。其中，转化生长因子β1(TGFβ1)在其细胞因子网络失衡调控中起着关键作用[1]。TGFβ1主要是通过与成纤维细胞上的TGFβRⅡ结合从而激活TGFβ/Smads信号转导通路，使胶原过度沉积导致肺纤维化的发生发展。在治疗上，主要给予肾上腺糖皮质激素和免疫抑制剂，但效果不甚理想且副作用明显，而具有活血化淤功效的中药在防治器官纤维化方面具有良好的前景。近年来有研究显示，阿魏酸钠对大鼠肝纤维化和肾间质纤维化具有一定的抑制作用[2-3]，但关于阿魏酸钠能否抑制肺纤维化，目前报道较少。有鉴于此，我们以大鼠气管内滴入博来霉素建立肺纤维化模型，通过分析阿魏酸钠对大鼠肺组织TGFβRⅡmRNA及Ⅰ型胶原纤维表达的影响，初步探讨阿魏酸钠对肺纤维化的疗效，为其治疗肺纤维化提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 ①动物和试剂：选择7周龄二级健康SD大鼠30只 (四川大学华西实验动物中心提供)，体重150g～250g，雌雄各半；阿魏酸钠(成都亨达药业有限公司)；博莱霉素(15mg/支)；丽春红S(北京欣经科生物技术有限公司)，维多利亚兰B(上海化学试剂公司)，兔抗大鼠Ⅰ型胶原抗体、SABC试剂盒、DAB显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；转化生长因子TGFβ受体ⅡmRNA(TGFβRⅡmRNA)原位杂交试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)②主要仪器：TE2000-u荧光相差倒置生物显微镜，COOLPIX450高级数码相机，Imagepro plus专业图像分析软件。

1.2 将大鼠随机分为3组 对照组、肺纤维化组和阿魏酸钠治疗组，每组10只大鼠。肺纤维化组和阿魏酸钠治疗组大鼠气管内滴入博莱霉素(5mg/kg体重，溶于0.3ml生理盐水)，建立肺纤维化模型。对照组予等量生理盐水气管内滴入。从第2天起，阿魏酸钠治疗组大鼠每天给予阿魏酸钠(150mg/kg体重，溶于3ml生理盐水)灌胃，肺纤维化组和对照组大鼠予以3ml生理盐水灌胃,共28天。第29天，处死大鼠，剪下左肺下叶于4%多聚甲醛(含0.1%DEPC)中固定后，常规石蜡包埋，切片，分别进行HE染色、免疫组化法(S-P法)检测I型胶原纤维，原位杂交试检测TGFβRⅡmRNA。实验步骤严格按照试剂盒说明书进行。图像采集及分析定量：利用由TE2000-u荧光相差倒置生物显微镜，COOLPIX450高级数码相机，Image-proplus专业图像分析软件构成的图像采集和分析系统，于免疫组化切片的上下左右四个视野各采集一张100倍的图像，每张图像先进行颜色分离，然后自动计算肺组织内Ⅰ型胶原纤维的积分光密度(IOD)值，4张图像的IOD平均值作为该片肺组织内Ⅰ型胶原纤维的IOD代表值。对于TGFβRⅡmRNA原位杂交切片，同样先用软件进行颜色分离，然后采用相同的方法计算肺组织TGFβRⅡmRNA的IOD代表值。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0软件进行统计学分析，所测数据以±s表示，组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠肺组织病理改变和细胞数采集结果 对大鼠肺组织HE染色切片进行观察可见，对照组肺组织结构正常，肺泡间隔无明显充血及水肿，肺泡内未见明显炎性细胞。模型组肺泡间隔明显增宽伴明显充血水肿，重度纤维组织增生，肺泡腔变形，其中含有较多炎性细胞。阿魏酸钠治疗组肺泡结构基本正常，肺泡间隔增宽较模型组明显减轻，炎性细胞浸润较轻，纤维化改变不明显。

2.2 免疫组化检测Ⅰ型胶原纤维结果 对照组I型胶原纤维仅在气管周围弱表达；而在模型组中，I型胶原纤维广泛分布于支气管上皮下组织、肺间质及血管周围；经过阿魏酸钠治疗后，表达于支气管上皮下组织、肺间质及血管周围的Ⅰ型胶原纤维明显减少。模型组Ⅰ型胶原纤维的表达(0.97±0.34)明显高于对照组(0.27±0.08)(P＜0.001)；阿魏酸钠治疗组(0.39±0.25)较模型组表达减弱，差异有显著性(P＜0.001)，而与对照组比较没有明显差异(P＞0.05)。结果见表1。

2.3 各组大鼠肺组织TGFβRⅡmRNA比较 原位杂交染色可见，对照组肺组织形态正常，可见少许散在炎性区，TGFβRⅡmRNA表达较少。模型组肺组织肺泡壁明显增厚，在增厚的肺泡壁及血管周围可见明显TGFβRⅡmRNA表达；阿魏酸钠治疗组肺组织内TGFβRⅡmRNA表达降低。结果见表2。

表1 各组大鼠肺组织I型胶原纤维的表达情况(±s)

表1 各组大鼠肺组织I型胶原纤维的表达情况(±s)

注：与对照组比较 *P＜0.001**P＞0.05；与模型组比较，#P＜0.001

组别 样本数 I型胶原纤维(IOD)对照组 9 0.27 ± 0.08模型组 10 0.97 ± 0.34*阿魏酸钠治疗组 9 0.39 ± 0.25 **#

表2 各组大鼠肺组织TGFβRⅡmRNA的表达情况(±s)

表2 各组大鼠肺组织TGFβRⅡmRNA的表达情况(±s)

注：与对照组比较 *P＜0.01**P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05

组别 样本数 TGFβRⅡmRNA(IOD)对照组 9 0.078 ± 0.035模型组 10 0.178 ± 0.090*阿魏酸钠治疗组 9 0.121 ± 0.025**#

3 讨论

肺纤维化的主要病理特点是早期的弥漫性肺泡炎和后期大量成纤维细胞的病理性增生及基质胶原纤维进行性积聚并取代正常肺组织结构[4]。胶原纤维是肺组织的细胞外基质的主要成分。正常情况下，肺内胶原代谢处于动态平衡，对维持肺间质和肺泡的正常结构和功能起着非常重要的作用。博莱霉素气管内一次性注入制备的肺纤维化大鼠模型是目前公认的比较符合肺纤维化病理演变的模型[5]。本实验中，HE切片显示模型组肺泡组织明显充血、水肿，表明模型组的纤维化程度严重。免疫组化显示，对照组I型胶原纤维仅在气管周围弱表达，而模型组I型胶原纤维广泛分布于支气管上皮下组织、肺间质及血管周围，且表达较对照组有显著差异(P＜0.001)。以上结果表明本实验成功地复制了博莱霉素诱导的大鼠纤维化模型。

阿魏酸钠是当归、川芎等多种中药的有效成分。药理研究认为，阿魏酸钠为非肽类内皮素受体拮抗剂，可拮抗内皮素引起的血管收缩、升压及血管平滑肌细胞增殖的作用，从而可减轻血管内皮损伤；并且有抑制血小板聚集、抗凝血、改善血液流变学等作用。此外还具有清除自由基、增强免疫功能等多种药理作用[6]。

本研究发现，阿魏酸钠治疗组肺组织的病理学改变较肺纤维化组有较大改善，纤维化程度明显减轻；阿魏酸钠治疗组I型胶原纤维含量也较模型组明显减少，差异有统计学意义(P＜0.001)，这提示阿魏酸钠具有一定的抗肺纤维化作用。

TGFβRⅡ是肺纤维化过程中炎性细胞因子TGF-β信号转导通路上的一种细胞表面受体，为含有丝氨酸/苏氨酸激酶的糖蛋白。TGF-β在细胞内转导，先要与特异性Ⅱ型受体结合，通过形成受体四聚体复合物，继而发挥细胞内TGF-β信号转导作用。有研究报道，在动物实验中，可溶性Ⅱ型受体抗体中和TGF-β可以阻止TGF-β与靶细胞上的受体结合，显著减轻博莱霉素诱导的肺纤维化。

我们的结果显示，经阿魏酸钠治疗后，TGFβRⅡmRNA的表达较模型组降低(P＜0.05)。进一步提示阿魏酸钠可能通过减少TGF-β/Smads信号转导通路中的关键受体分子TGFβRⅡmRNA的表达，抑制TGF-β细胞内信号转导，使I型胶原纤维合成减少，从而起到抗纤维化的作用。

[1]Xaubet A,Marin-Arguedas,Lario S,et al.Transforming growth factor beta-1 gene polymorphisms are associated with disease progression in idiopathic pulmonary fibrosis[J].Am J Respiratory&Critical Care Medicine2003,168(4):413-415.

[2]贺德,曾志良,曹建华,等.阿魏酸钠抗大鼠肝纤维化[J].世界华人消化杂志,2002,10(2):240-241.

[3]陈辉珍,樊均明.阿魏酸钠与肾间质纤维化关系的探讨[J].中药新药与临床药理,2003,14(5):353-355.

[4]王耀勇,徐启勇,叶燕青,等IL-10在博莱霉素诱导大鼠所致肺纤维化中的作用[J]武汉大学学报(医学版),2004, 25(2):159-165.

[5]Clark JG,Kostal KM,Marino BA.Bleomycin-induced pulmonary fibrosis in hamster.An alveolar macrophage product increases fibroblast prostaglandin E2and cyclic adenosine monophosphate and suppresses fibroblast proliferation and collagen production[J].J Clin Invest,1983,72:2082-2091.

[6]刘向峰,李娜.阿魏酸钠的临床应用[J].宁夏医学杂志,2005,27(1):69-70.

10.3969/j.issn.1009-4393.2010.21.057

550004 贵州贵阳医学院附属医院感染科 (穆茂)610041四川成都大学华西医院呼吸内科 (程德云 聂莉 杨礼腾 胡晓波 方询陈文彬)

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