吕氏泰勒虫主要表面蛋白P32基因的克隆与序列分析*

刘爱红,关贵全,刘军龙,李有全,马米玲,牛庆丽,任巧云,殷 宏,罗建勋

(中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室 甘肃省动物寄生虫病重点实验室农业部草食动物疫病重点实验室,甘肃兰州 730046)

吕氏泰勒虫主要表面蛋白P32基因的克隆与序列分析*

刘爱红,关贵全,刘军龙,李有全,马米玲,牛庆丽,任巧云,殷 宏*,罗建勋*

(中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室 甘肃省动物寄生虫病重点实验室农业部草食动物疫病重点实验室,甘肃兰州 730046)

从吕氏泰勒虫宁县株中提取RNA,用RT-PCR方法扩增主要表面蛋白P32基因的cDNA片段,克隆后测定其核苷酸序列,并推导了相应的氨基酸序列。结果表明,扩增的P32基因长度为875个核苷酸,共编码284个氨基酸。核苷酸序列与已发表的牛的4种泰勒虫的主要表面蛋白基因相比较,其与瑟氏泰勒虫俄罗斯株、日本株、中国辽阳株的核苷酸和氨基酸序列相似性均在98.9%以上。其推导的氨基酸序列中有3个糖基化位点。

吕氏泰勒虫;表面蛋白P32基因;克隆;序列分析

绵羊和山羊泰勒虫病(Ovine and caprine theileriosis)是媒介蜱传播的由泰勒科泰勒属的原虫寄生于绵羊和山羊巨噬细胞、淋巴细胞和红细胞内所引起的疾病的总称[1]。在我国,羊泰勒虫病主要由青海血蜱与长角血蜱传播,且该病分布与传播媒介蜱的分布息息相关。羊泰勒虫主要分布于我国的四川、青海、甘肃、辽宁、内蒙古、陕西、河北和宁夏等地。该病可引起羔羊与外地引进羊大量死亡,使慢性发病的山羊和绵羊发育迟缓,产肉量和产毛量显著下降,从而给养羊业造成重大经济损失[2]。

泰勒虫主要表面蛋白P32基因是红细胞感染阶段的一种虫体表面蛋白[3],具有较好的免疫原性与反应原性[4],是诊断和预防泰勒虫病理想的抗原。近年国内外尚未见该基因在羊泰勒虫方面的报道。本试验采用RT-PCR方法,克隆吕氏泰勒虫主要表面蛋白P32基因,并与GenBank中登录的牛的4种泰勒虫主要表面蛋白基因进行相似性分析,为我国羊泰勒虫病的免疫诊断和防控奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 虫体 吕氏泰勒虫宁县株是采自甘肃省宁县疫区感染羊的血液,从试验接种切除脾脏的羊分离获得。

1.1.2 动物 6月龄～12月龄的羔羊购自无泰勒虫病和媒介蜱分布的地区。在试验开始前30 d,所有用于虫体繁殖的羊均被切除脾脏,并进行病原学检查,只有血涂片检查无任何血液原虫感染的动物才能用于本试验。

1.1.3 主要生化试剂 RNA抽提试剂Trizol L S Reagent为Invitrogen公司产品;AMV反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA片段纯化回收试剂盒、质粒提取试剂盒,TaqDNA 聚合酶、dNTP、EcoR Ⅰ、X-gal、DNA Marker、JM109感受态细胞均购自宝生物工程(大连)有限公司;pGEM-T Easy载体购自Promega公司。其他常规试剂均为国产分析纯级产品。

1.2 方法

1.2.1 虫体分离与纯化 用液氮中保存的含虫血液分别接种动物,当染虫率达到15%以上,静脉采血,采用低渗崩解、差速离心等方法分离纯化羊泰勒虫裂殖子。

1.2.2 虫体RNA的提取 按Trizol RNA抽提试剂盒说明书进行,所用器皿和试剂经DEPC水处理。

1.2.3 引物的设计与合成 根据GenBank上已发表的牛瑟泰勒虫主要表面蛋白P32基因序列,在基因开放阅读框两侧合成了一对引物,预扩增长度为875 bp。该引物由宝生物工程(大连)有限公司合成 。 引 物 1:5′-CACGCTATGT TGTCCAAGAG-3′,引物 2:5′-TGTGACACTCAATGCGCCTA-3′。

1.2.4 目的基因的RT-PCR扩增 PCR扩增在50 μ L反应体系中进行,该系统中含 10×PCR缓冲液 5 μ L,dNTP 混合 物 4 μ L,上 下 游 引 物 1 μ L 20 pmol/μ L,DNA 模板 1.25 μ L,灭菌去离子水37.75 μ L,TaqDNA 聚合酶 0.25 μ L,反应程序为:94℃预变性3 min;94℃1 min,57℃1 min,72℃1 min,30个循环;72℃再延伸5 min。

1.2.5 PCR扩增片段的纯化与回收 按宝生物工程(大连)有限公司DNA胶回收试剂盒使用说明书,纯化并回收扩增的目的基因片段。

1.2.6 目的基因的克隆 将回收的PCR产物按试剂盒说明书连接到pGEM-T Easy载体上,总体积为10 μ L,混匀后于4℃过夜,然后导入JM109感受态细胞,轻轻地振荡混匀,冰浴30 min,42℃热激90 s,立即冰浴 3 min。然后加入 800 μ L 预热至37℃的 LB培养基,37℃以150 r/min振荡培养1 h,室温800 r/min离心 5 min,弃上清液。混合剩余的培养液和细胞沉淀,在无菌条件下涂布于含氨苄青霉素(100 μ g/mL)、X-gal 16 μ L 、IPTG 4 μ L 的LB琼脂平板上,于37℃培养12 h～16 h后转移至4℃,使蓝斑充分显现,挑取白色菌落,用质粒提取试剂盒纯化质粒,然后用EcoRⅠ酶切鉴定并进一步作PCR鉴定。

1.2.7 目的基因的核苷酸序列测定 将酶切和PCR扩增鉴定均为阳性的克隆过夜培养,取1 mL菌液送宝生物工程(大连)有限公司,用双脱氧链终止法进行测序。DNA Star 6.0软件分析其推导的氨基酸序列,并与已发表的牛的泰勒虫同基因推导的基因氨基酸序列进行相似性比较。

1.2.8 蛋白质结构与功能分析 登录http://www.expasy.org网站进行信号肽和跨膜区分析,并检索蛋白质的功能位点。

2 结果

2.1 主要表面蛋白P32基因的RT-PCR扩增

对吕氏泰勒虫宁县株的主要表面蛋白P32基因进行了RT-PCR扩增,产物用15 g/L琼脂糖凝胶电泳进行了检测。结果在875 bp处有1条较亮的特异性扩增带(图1),与预期的扩增片段相符,且特异性和重复性好。初步表明用RT-PCR方法获得的扩增片段为主要表面蛋白P32基因片段。

图1 目的基因的RT-PCR扩增产物Fig.1 The RT-PCR products of P32 gene

2.2 目的基因的核苷酸序列测定

将扩增得到的P32基因cDNA片段克隆进pGEM-T Easy载体中,筛选出含有P32基因的阳性克隆,测定其核苷酸序列,获得吕氏泰勒虫宁县株主要表面蛋白P32基因的核苷酸序列,并据此推导出其相应的氨基酸序列(图 2)。下划线部分为信号肽;阴影部分为糖基化位点。

结果表明,插入片段的长度为875 bp,含有一个完整的开放阅读框,编码284个氨基酸,氨基酸的分子质量约为32 ku。其中N端23个氨基酸为信号肽。本研究克隆测序得到的P32基因序列已提交GenBank,登录号为GQ281044。

图2 吕氏泰勒虫主要表面蛋白P32基因推导的氨基酸序列Fig.2 The deduced amino acid sequence from P32 gene of Theileria luwenshuni

2.3 主要表面蛋白P32基因序列分析

将所测定的P32基因序列通过NCBI BLAST程序与GenBank中注册的牛的泰勒虫主要表面蛋白基因的核苷酸序列进行分析比较,其核苷酸序列同源性见表1。核苷酸同源性分析表明,分离的吕氏泰勒虫宁县株主要表面蛋白P32基因核苷酸序列与牛瑟氏泰勒虫日本株(AB016280)、俄罗斯株(AB016279)、我国辽阳株(FJ515688)的同源性分别为99.6%、99.8%、99.7%;而与水牛泰勒虫、中华泰勒虫、环形泰勒虫、小泰勒虫的同源性较低,分别是85.3%、73.5%、52.3%、49.0%。通过所建立的系统发育树表明(图3),吕氏泰勒虫宁县株与3株牛的瑟氏泰勒虫位于同一小分支,而与水牛泰勒虫、中华泰勒虫、环形泰勒虫、小泰勒虫明显位于不同的进化支。

表1 吕氏泰勒虫主要表面蛋白P32基因与已发表的主要表面蛋白基因核苷酸和氨基酸同源性比较Table 1 Comparison of MPSP P32 of Theileria luwenshuni nucleotide sequences and the deduced amino acid sequences of 8 published MPSP genes

图3 系统进化树Fig.3 Phy logenetic tree

2.4 蛋白质的基本性质分析

应用位于Expasy站点上的各种分析软件对蛋白质序列进行了分析。信号肽分析表明,1位～23位氨基酸残基为信号肽序列(图2),推断该蛋白为融合性蛋白。蛋白跨膜区分析表明,在2位～21位、266位～282位之间存在两个跨膜区。

2.5 功能位点分析

经采用 http://www.expasy.org/prosite的PROSIT E数据库检索,该蛋白序列包含3个糖基化位点、4个丝氨酸磷酸化位点、4个苏氨酸磷酸化位点和3个酪氨酸磷酸化位点。

3 讨论

羊泰勒虫病是严重危害养羊业的蜱传性血液原虫病,是我国北方农区、半农半牧区及半林半牧区绵羊、山羊的常发病之一。目前国内外报道的羊泰勒虫至少有6个种,即莱氏泰勒虫(T.lestoquardi)、绵羊泰勒虫(T.ovis)、分离泰勒虫(T.separata)、隐藏泰勒虫 (T.recondita)、吕氏泰勒虫(T.luwenshuni)和尤氏泰勒虫(T.uilenbergi)。其中绵羊泰勒虫、分离泰勒虫和隐藏泰勒虫属于温和型泰勒虫;莱氏泰勒虫、吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫属于恶性泰勒[5-7]。然而,吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫属于我国的2个新种,它们分别由长角血蜱与青海血蜱传播[8-9]。根据羊泰勒虫病传播与发展的三个环节,即泰勒虫、媒介蜱和宿主(绵羊和山羊)之间的复杂关系以及泰勒虫主要表面蛋白是红细胞感染阶段的一种虫体表面蛋白,具有较好的免疫原性,是诊断和预防泰勒虫病的理想抗原。笔者从血液中分离纯化出吕氏泰勒虫裂殖子,提取RNA,反转录合成cDNA,经RT-PCR扩增出875 bp的基因片段,将该基因片段克隆到pGEM-T Easy载体,测得吕氏泰勒虫宁县分离株P32基因的核苷酸序列。经分析表明,该株吕氏泰勒虫的核苷酸与对应的氨基酸与牛的瑟氏泰勒虫的同源性较高,其中与瑟氏泰勒虫日本株(AB016280)、俄罗斯株(AB016279)、我国辽阳株(FJ515688)的核苷酸同源性分别为99.6%、99.6%和99.7%;氨基酸同源性分别为98.9%、99.3%和98.9%。从系统发育树可以看出,吕氏泰勒虫宁县株与日本株、俄罗斯株和辽阳株进化途径一致,位于同一小分支。而与水牛泰勒虫、中华泰勒虫、环形泰勒虫和小泰勒虫明显处于不同的进化分支上。本试验中主要表面蛋白P32基因序列在泰勒虫当中的保守性高,对抗原性影响较小。本研究数据已提交至GenBank,登录号GQ281044,为我国羊泰勒虫病的监测与防控提供了理论依据和技术资料储备。同时用生物学软件分析发现,主要表面蛋白序列含有3个糖基化位点,11个磷酸化位点及2个跨膜区。

随着我国养羊业的发展与传播媒介长角血蜱与青海血蜱的分布范围的扩大,羊泰勒虫病的危害越来越严重,能有效、快速预防和检测羊泰勒虫病成为当务之急。国内对羊泰勒虫病的检测主要依据血涂片染色镜检和血清学方法,而这两种方法存在误差大、抗原来源不足等缺点。由于裂殖子是泰勒虫的主要致病阶段,因此,裂殖子表面抗原的研究始终是一个热点。研究最多的是泰勒虫虫体表面抗原(裂殖子表膜蛋白,又称p32),该抗原是被宿主免疫系统识别的一种主要靶抗原,具有很强的免疫原性[14],通过免疫电镜发现其在裂殖子表面大量表达。笔者将进一步把首次从国内分离的这株吕氏泰勒虫表面蛋白P32基因分析其抗原性,为今后羊泰勒虫病的诊断和控制奠定基础。

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Cloning and Sequencing Analysis of the Major Surface Protein P32 Gene ofTheileria luwenshuni

LIU Ai-hong,GUAN Gui-quan,LIU Jun-long,LI You-quan,MA Mi-ling,NIU Qing-li,REN Qiao-yun,YIN Hong,LUO Jian-xun

(Key Laboratory of Veterinary Parasitology of Gansu Province,State Key Laboratory on Veterinary Etiological Biology,Lanzhou Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou,Gansu,730046,China)

The major surface protein P32 gene ofTheileria luwenshuniisolated from Ningxian county in Gansu province was successfully amplified by RT-PCR.The amplicon was 875bp in length,coding for 284 amino acid residues,and had above 98.9%of identity with three strainsT.sergentifrom Jap/Rus/China.The deduced peptide of 284 amino acid residues contained 3 glycosylation sites.The research data were submitted to GenBank and gained a new accession No.GQ281044.The result provided the foundation of the immunological diagnosis and prevention for ovine theileriosis in our county.

Theileria luwenshuni;surface protein P32 gene;clone;sequence analysis

S852.7

A

1007-5038(2010)02-0007-04

2009-08-27

国家自然科学基金项目(30571397);国家(863)项目(2006AA10A206);国家“十一五”科技支撑计划项目(2006AA10A207)

刘爱红(1975-),女,甘肃陇西人,助理研究员,硕士,主要从事兽医原虫分子生物学研究。*通讯作者