猪传染性胸膜肺炎放线杆菌和猪圆环病毒2型二重实时荧光定量PCR检测方法的建立*

庞耀珊,谢芝勋,黄 琦,谢丽基,邓显文,谢志勤,刘加波

(1.广西兽医研究所,广西南宁 530001;2.广西南宁市水产畜牧兽医局,广西南宁 530028)

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌和猪圆环病毒2型二重实时荧光定量PCR检测方法的建立*

庞耀珊1,谢芝勋1,黄 琦2,谢丽基1,邓显文1,谢志勤1,刘加波1

(1.广西兽医研究所,广西南宁 530001;2.广西南宁市水产畜牧兽医局,广西南宁 530028)

以胸膜肺炎放线杆菌(App)apxⅣA基因和猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因为靶基因,分别设计特异性引物和探针,建立App和PCV-2的二重荧光PCR方法。App引物扩增的目的片段大小为132 bp,PCV-2为169 bp。建立的方法可在同一反应体系中同时对App和PCV-2进行定量检测鉴别,其敏感性分别为1×101拷贝和1×100拷贝,对其他猪病病原核酸的检测为阴性。利用该方法对10份人工感染临床样品进行检测试验,其结果符合率达100%,说明该方法可用于对临床样品中App和PCV-2的检测。

实时荧光PCR;胸膜肺炎放线杆菌;猪圆环病毒2型

猪传染性胸膜肺炎(Infectious pleuropneumonia of swine,IPPS)和猪圆环病毒2型(PCV-2)感染是猪的两种主要呼吸道疾病。近年来随着规模化养猪业的发展,这两种疾病在我国呈上升趋势,并成为当前严重危害我国养猪业的疾病之一,给养猪业造成严重的经济损失[1-4]。IPPS由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,App)引起,以急性出血和慢性纤维素性坏死性胸膜肺炎为主要特征,是一种高度致死性传染性呼吸道疾病。App可存在于健康猪的扁桃体、鼻腔、气管中,成为主要的传染源,或在猪群抵抗力下降时迅速增殖,导致疫病暴发[5]。PCV-2是新发现的一种免疫抑制性病毒,侵害猪的免疫系统,导致其抵抗力下降而容易诱发其他疾病。该病同时也是引发断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原,患病猪呼吸困难、贫血,出现明显的淋巴组织病变和渐进性消瘦[5]。IPPS和PMWS临床症状相似,均主要侵害6周龄～12周龄的断奶仔猪。病猪表现为渐进性消瘦、黄疸和呼吸困难,剖检可见淋巴结肿大,间质性肺炎,肺部弥漫性充血,肾脏苍白等症状。临床上这两种病原混合感染现象十分普遍[6-7],常规方法难以鉴别诊断。实时荧光定量PCR是一种融PCR和DNA探针杂交技术为一体的基因体外扩增技术,它通过实时检测PCR产物荧光信号的变化而达到检测病原核酸的目的,该技术具有操作简便、结果直观、敏感性高、特异性强、重复性好等优点,已成为动物病原检测的重要方法。另外,该技术还可以根据建立的标准曲线,直接从检测到的荧光阈值推算样品中相应病原的含量。在临床检测和对疾病进程的评价上具有很高的实用价值[8-9]。

本研究根据 App apxⅣA毒素基因和PCV-2 ORF2基因的保守序列,分别设计特异性的引物和荧光标记探针,建立了可同时检测App和PCV-2的二重实时荧光定量PCR方法。

1 材料与方法

1.1 材料

App血清1型～10型(5型除外)国内标准株购自中国兽医药品监察所,血清5型分离株为北京市农林科学院畜牧兽医研究所陈小玲研究员惠赠;PCV-2标准毒其他猪源致病菌和病毒的毒株、临床样品均由广西兽医研究所兽医生物技术研究室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物及探针设计 根据GenBank登录的App序列(AF188867)和PCV-2序列(EF210106),分别针对App的apxⅣA基因和PCV-2的ORF2基因设计引物和探针,如表1所示。引物和探针由宝生物工程(大连)有限公司合成。

表1 App和PCV-2的特异性引物和荧光标记探针Table 1 Specific primers and fluorescence-labeled probes of App and PCV-2

1.2.2 App apxⅣA和PCV-2 ORF2重组质粒的构建 App菌株涂布接种于添加1 g/L NAD和50 mL/L马血清的PPLO平板上,在体积分数为5%的CO2条件下37℃培养24 h,用灭菌水洗下平板上的菌落,离心收集细菌。分别按文献[10-11]方法提取App和PCV-2的DNA作为模板。通过PCR扩增,得到App apxⅣA基因的132 bp DNA片段和PCV-2 ORF2基因的169 bp DNA片段。扩增产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳回收纯化后,连接到pMD-18T载体,分别构建App apxⅣA和 PCV-2 ORF2重组质粒,转化大肠埃希菌DH5α,经PCR、酶切及测序等鉴定,得到阳性重组质检。利用DNA小量快速抽提试剂盒抽提阳性重组质粒DNA,通过紫外分光光度计测定其OD260和OD280,计算浓度,同时按10倍系列稀释备用。

1.2.3 二重实时荧光PCR的优化建立

1.2.3.1 引物和探针用量的优化 采用20 μ L反应体系,其中 2×Premix ExTaqTM10 μ L,App 和PCV-2 上 、下游引物各 0.5 μ L,DNA 模板 5 μ L,超纯水 3.4 μ L,App 探针 和 PCV-2 探 针各 0.3 μ L。反应程序为:95℃20 s,95℃5 s、60℃25 s循环40次。在 Lightcycler 2.0 Real-time PCR仪(Roche公司)上,应用App和PCV-2阳性质粒DNA混合物为模板,对App和PCV-2的引物、探针等进行不同浓度的方阵试验,筛选出能同时扩增 App和PCV-2,且对Ct值和扩增效率影响不大的使用量。

1.2.3.2 颜色补偿试验 利用经1.2.3.1优化后的App、PCV-2引物和探针浓度,分别对 530、610荧光通道进行颜色补偿试验,并以water通道为空白对照。在反应进行至40个循环后加一个颜色补偿程序,连续收集荧光值,保存试验结果备用。

1.2.3.3 App和PCV-2二重荧光PCR的建立

利用经1.2.3.1优化后的App、PCV-2引物和探针浓度,应用相同的反应程序,对10倍系列稀释的App、PCV-2 DNA混合物模板进行扩增,单点收集荧光数据。反应结束后,利用仪器自带软件(Light-CyclerSoftware 4.05)加载1.2.3.2的颜色补偿试验数值,分析所获得的标准曲线和直线回归方程,建立App和PCV-2二重荧光PCR。

1.2.4 二重荧光PCR技术特性分析

1.2.4.1 特异性试验 以国内10个血清型的App菌株、1个PCV-2毒株以及其他对照常见猪病原,如猪链球菌、多杀性巴氏杆菌、大肠埃希菌等为对照供试材料,制备核酸模板进行荧光PCR。其中细菌病原模板通过热裂解法制备,即适量的菌液煮沸5 min后,4 000 r/min离心2 min,取上清作为反应模板。DNA病毒则利用酚/氯仿抽提,RNA病毒用Trizol抽提。将所制备的病原模板加入到二重荧光PCR反应体系,按1.2.3.3中的反应条件进行扩增,同时以超纯水作空白对照,测定本方法特异性。

1.2.4.2 敏感性试验 将同时含有等量浓度的App和 PCV-2 DNA 混合物,从 2×107拷贝/μ L开始进行10倍系列稀释至2×10-1拷贝/μ L,分别取1 μ L各浓度梯度稀释液作模板,按1.2.3.3中的反应条件进行扩增,测定本技术的敏感性。

1.2.4.3 稳定性试验 对浓度分别为2×104、2×103、2×102拷贝/μ L,同时含有 App和 PCV-2两种病原的标准阳性质粒DNA进行扩增,每个浓度设置3个重复。对所有反应的Ct值进行统计学分析,评价本技术的稳定性。

1.2.4.4 干扰性试验 将App和PCV-2两种阳性质粒DNA标准品按 10倍系列稀释至 2×107拷贝/μ L,并组合成不同的浓度梯度进行扩增,检测两种模板浓度相差较大时是否存在干扰现象。

1.2.5 临床样品检测试验 10份分别从人工感染试验猪采集的组织样品,其中2份为App感染材料,2份为 PCV-2感染材料,2份分别为不同App和PCV-2感染材料的混合物,4份为健康对照组织样品。利用1.2.2方法抽提样品核酸作为模板,对本研究所建立的二重荧光PCR方法的可靠性进行验证。

2 结果

2.1 App apxⅣA和PCV-2 ORF2重组质粒的构建

采用针对App apxⅣA和PCV-2 ORF2所设计的特异性引物,分别对App 259和PCV-2 DNA模板进行扩增,将所得到 App 132 bp和PCV-2 169 bp的目的片段分别与pMD-18T载体连接构建重组质粒,该重组质粒经PCR鉴定以及序列测定,结果与预期设计一致(图1)。

图1 重组质粒的PCR鉴定结果Fig.1 PCR amplification fo r recombinant plasmids

2.2 二重荧光PCR的建立

不同浓度的App、PCV-2引物和探针的方阵试验结果为在20 μ L的反应体系中,App和PCV-2的上 、下游引物最佳用量分别为 10 μ mol/L 0.4 μ L,探针分别为 5 μ mol/L 0.4 μ L。同时,对 530 和 610荧光通道进行颜色补偿。利用上述条件,建立标准曲线和回归方程,对不同浓度的App和PCV-2混合DNA模板进行扩增反应,结果App标准阳性质粒DNA 模板在101拷贝/μ L～107拷贝/μ L之间扩增结果有很好的线性关系,扩增效率为1.864,标准误差为0.059 2;PCV-2标准阳性质粒DNA模板则在100拷贝/μ L～107拷贝/μ L之间有很好的线性关系,扩增效率为1.825,标准误差为0.098 8。

2.3 二重荧光PCR技术特性分析结果

2.3.1 特异性试验结果 经荧光PCR扩增,10个血清型App菌株均能收集到强烈的荧光信号并出现扩增曲线,而对照病原和空白对照均收集不到荧光信号,也无扩增曲线出现。

2.3.2 敏感性试验结果 App的阳性质粒最低检出限量为10个拷贝,PCV-2的阳性质粒最低检出限量为1个拷贝。

2.3.3 稳定性试验结果 对2×104、2×103、2×102拷贝/μ L不同浓度的App和PCV-2的标准阳性质粒DNA进行扩增,通过对所得到的Ct值、算术平均值标准偏差及变异系数等参数的分析,结果发现,Ct值的变异系数均小于5%,差异不显著(表2)。

表2 二重实时定量PCR稳定性试验结果Table 2 Results of stability test of duplex real-time PCR

2.3.4 干扰性试验结果 将App和PCV-2两种阳性质粒DNA标准品按不同浓度组合,经荧光PCR扩增,各浓度组合均得到相应的扩增曲线。

2.4 临床样品检测结果

利用建立的二重荧光PCR方法,对供试的10份临床样品进行检测,结果该方法仅对其中含有App或PCV-2以及同时含有App和PCV-2的阳性样品出现扩增曲线,而对那些含其他病原的阴性样品无扩增,符合率100%。

3 讨论

实时荧光定量PCR是一种融合了PCR和DNA探针杂交技术的基因体外扩增技术。该技术通过在密闭系统中自动、实时地收集荧光信号来探测DNA模板扩增量的变化,实现了对病原核酸的快速、准确检测以及定性、定量分析,避免了在检测过程中的人为污染。该技术具有特异性好、敏感性高、重复性好、干扰性低等优点,已被广泛应用于生命科学的多个领域。

App和PCV-2是两种当前严重危害我国养猪业的猪病,临床上混合感染现象十分普遍。传统方法对这两种疾病进行诊断时,操作繁琐复杂,特异性和敏感性较低,往往由于技术本身的局限性难以得出准确的诊断结果。特别是混合感染病例,更加难以鉴别确诊。常规PCR[10]和套式PCR[12]虽具有较高的特异性和敏感性,但其耗时数小时,并且一次只能检测一种病原。而多重实时荧光定量PCR技术一次操作就可以同时检测鉴别App和PCV-2两种病原,并可以在检测过程中实时监测扩增结果。与传统方法和常规PCR、套式PCR相比,其在检测速度、特异性和敏感性以及定量分析方面具有这些方法所无法比拟的优势,在临床上有很高的应用价值。

在二重或多重实时荧光PCR技术中,不同引物和探针之间往往会相互干扰而影响模板的扩增。为了最大限度地降低这种干扰,本试验设计了不同浓度引物和探针的方阵试验和颜色补偿试验。通过试验,得到App和PCV-2的上、下游引物最佳用量分别为 10 μ mol/L 0.4 μ L,探 针 分 别 为 5 μ mol/L 0.4 μ L,并对两种探针(FAM 和ROX)在530和610通道进行了颜色补偿。经颜色补偿后,App和PCV-2的扩增效率分别为1.864和1.825,标准误差分别为0.059 2和0.098 8,各组数值之间差异不大,表明App和PCV-2均得到了很好的扩增。

建立的二重实时荧光PCR特性试验结果显示,对所有供试App和PCV-2均能收集到强烈的荧光信号并出现扩增曲线,而对照病原无荧光信号,也不出现扩增曲线;其对App的最低检出量为10拷贝,PCV-2为 1拷贝;对不同浓度及不同浓度组合的App和PCV-2进行检测,其变异系数差异不显著,两种模板均能得到良好的扩增。这些结果表明,本方法具有很强的特异性、敏感性和稳定性,可以用于对App和PCV-2的鉴别检测。敏感性试验结果还表明,即使在病原含量较低的感染初期,或App和PCV-2两种病原感染量差异较大的临床混合感染样品,以及经某些方法如福尔马林固定、石蜡包埋等处理后,病原含量较低的感染组织,本技术同样适用,不受影响。

本技术对10份分别或同时含有App和PCV-2的临床阳性样品及其他病原的阴性样品进行检测,其结果符合率达100%。说明本Real-time PCR技术检测结果可靠,可以作为一种临床诊断工具对这两种疾病病原直接进行检测。

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Development of a Duplex Real-time FQ-PCR for Detection ofActinobacillus pleuropneumoniaeand Porcine Circovirus Type 2

PANG Yao-shan1,XIE Zhi-xun1,HUANG Qi2,XIE Li-ji1,DENG Xian-wen1,XIE Zhi-qin1,LIU Jia-bo1

(1.Guangxi Veterinary Research Institute,Nanning,Guangxi,530001,China;2.Guangxi Fisheries,Husbandry&Veterinary Bureau,Nanning,Guangxi,530028,China)

A real-time PCR,based onTaqman hybridization probe technology,was developed and applied to detectAnctinobacillus pleuropneumoniae(App)and Porcine circovirus type 2(PCV-2).Two pairs of specific primers and two probes labeled were designed for specific amplification of App apxⅣA and PCV-2 ORF2 genes.The two amplified DNA specific fragments,132 bp for App and 169 bp for PCV-2 ORF2 genes were cloned into pMD-18T plasmid and transformed intoE.coliDH5α.The sensitivity of real time PCR for App and PCV-2 were 1×101copies and 1×100copies,respectively.The assay was specific for App and PCV-2,and reaction to other organisms was negative.10 experimental infection clinical samples were subjected to this real-time PCR.The results were matched to the experiment infection.It suggested that this real-time PCR can be used to detect the pathogens of App and PCV-2 in clinical samples.

real-time FQ-PCR;Actinobacillus pleuropneumoniae;Porcine circovirus type 2

S852.619

A

1007-5038(2010)02-0011-04

2009-08-21

广西区水产畜牧局科研计划项目(桂渔牧科061910、061909和072412);广西科技攻关项目(桂科攻0537008-3B和0322004-2A);新世纪百千万人才工程国家级人选专项基金项目(945200603)

庞耀珊(1967-),女,广西玉林人,研究员,主要从事动物疾病防治研究。