高效液相色谱-串联质谱法测定蜂蜜中硝基呋喃代谢物的研究

张平安，张建威，乔明武，唐贵芳

(河南农业大学 食品科学技术学院，河南 郑州 450002)

硝基呋喃类药物主要包括呋喃唑酮 (AOZ)、呋喃它酮 (AMOZ)、呋喃西林 (AHD)和呋喃妥因，是合成广谱抗生素，发现于1944年，曾作为治疗药物和饲料添加剂，用于治疗和预防埃希氏菌和沙门氏菌引起的哺乳动物消化道疾病。由于硝基呋喃类药物对人类健康具有潜在危害，欧盟将其列为A类禁用药物，并于1995年禁止在食用动物中使用。我国也于2002年颁布了禁止使用硝基呋喃类抗生素的禁令［1-2］。目前，硝基呋喃类药物是国际动物源性食品贸易的必检项目，成为发达国家限制第三国出口的贸易壁垒［3］。

硝基呋喃代谢产物可在酸性条件下水解，同时可用邻硝基苯甲醛 (2-NBA)衍生化，经提取和净化后，用液相色谱 (HPLC-UV)［3］、液相色谱质谱法［4］、液相色谱串联质谱法测定［4］。通常 LC-UV法只能检测AOZ和AMOZ，且检出限达不到欧盟规定的要求。而对于HPLC-MS欧盟认为只能用于硝基呋喃代谢产物的筛选实验，对检出的阳性结果必须再用HPLC-MS-MS进行验证。

我们采用代谢物水解与衍生化同步进行，液液萃取净化，液相色谱串联质谱检测，电喷雾电离正离子 (ESI+)，多反应监测 (RMR)模式检测，外标法定量，检验其在蜂蜜中硝基呋喃类药物及其代谢物测定上的适用性。

1 材料与方法

1.1 试剂材料

乙腈 (色谱纯);甲醇 (色谱纯);甲酸 (色谱纯);乙酸乙酯 (色谱纯);二甲亚砜;衍生剂(邻硝基苯甲醛2-NBA);氢氧化钠 (优级纯);盐酸 (优级纯)硝基呋喃代谢物标准品:AOZ、SEM·HC1、AMOZ、AHD·HC1(Sigma公司，纯度＞99.99%)。

1.2 仪器设备

API 4000液相色谱质谱联用仪:安捷伦1100液相色谱系统，三重四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源;涡旋混合器;电子天平;恒温箱;pH计;离心机;旋转蒸发仪;氮气吹干仪;5 mL移液枪;5 mL注射器;0.45 μm虑膜。

1.3 样品处理

1.3.1 水解及衍生

称取1.00 g蜂蜜样品于50 mL聚四氟乙烯离心管中，振荡15 min。4 000 r·min-1离心3 min，弃去上清液，加30 mL浓度为0.125 mol·L-1盐酸溶液，振荡5 min，加1.0 mL衍生剂快速混合振荡5 min后，置于37℃恒温箱反应16 h(过夜)。

1.3.2 净化

向水解溶液中加入1.5 mL浓度为2 mol·L-1的氢氧化钠溶液，用0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液和盐酸溶液调节溶液pH值到7.0。4 000 r·min-1下离心5 min，将上清液倾入250 mL分液漏斗中，残渣用5 mL水洗涤振荡2 min，4 000 r·min-1下离心2 min，上清液并入分液漏斗中。向分液漏斗中加入40 mL乙酸乙酯，振荡2 min，静置3 min。分层后将下层水相转移至另一分液漏斗中，用40 mL乙酸乙酯再提取1次，弃去水相。用10 mL水依次洗涤2个分液漏斗，弃去水相。

将乙酸乙酯层通过装有2 g无水硫酸钠的漏斗过滤至平底烧瓶中。50℃下旋转蒸发至3 mL左右，移至8 mL玻璃试管中，用5 mL乙酸乙酯分3次洗涤合并洗涤液于试管中，50℃氮气流下吹干。用定容液定容至1.0 mL，通过0.45 μm滤膜过滤至进样瓶中，进样LC-MS-MS分析。

1.3.3 液相和质谱系统条件

色谱柱。inertsil:ODS-3(2.1×150 mm，5 μm)。流动相组成为:(A)0.1% 甲酸溶液，(B)乙腈，梯度洗脱程序详见表 1。流速:0.3 mL·min-1。色谱柱温度:5℃。进样量:10 μL。

质谱系统条件。离子源:Turbo Ion Spray电喷雾。离子化方式:电喷雾正离子 (ESI+)电喷雾电压。5 500 V。离子源温度:450℃。气帘气压力:20 kPa。扫描方式:多重反应监测 (MRM)，其参数见表2。

表1 流动相组成和梯度洗脱程序

表2 多重反应监测的参数

1.3.4 标准曲线

取4种衍生过的代谢物混标 (各含100 ng·mL-1)5.0 mL用甲醇稀释至50.0 mL容量瓶中，浓度为10 ng·mL-1。分别取 10 ng·mL-1的上述混标100.0，200.0，500.0 μL和 1.0 mL，用定容液分别定容至1.0 mL，通过0.45 μm滤膜过滤至进样瓶中。则标准系列的浓度分别为1.0，2.0，5.0 和 10.0 ng·mL-1。

2 结果与分析

2.1 被测物的提取和衍生

鉴于硝基呋喃类抗生素代谢物以蛋白结合物形态存在于机体组织中，在适当酸性条件下，才能释放出来，对蜂蜜样品先用甲醇/水 (1+1)处理，可以去除大量的杂质，减少分析干扰。然后选择0.125 mol·L-1的盐酸溶液作为水解溶液。

硝基呋喃代谢物的分子量较小 (75～201)，在该范围内MS背景影响大，检测灵敏度低，故需衍生化后才能测定。采用邻硝基苯甲醛 (2-NBA)对代谢物的自由氨基团衍生化，形成具有较好质谱特性的化合物。水解与衍生化同时进行，而蜂蜜样品的基体主要是糖类，且为液体，因此所需时间较短，此处蜂蜜样品的质谱信号达到最大值的衍生反应时间为12 h。

2.2 净化条件的选择

虽然LC-MS-MS具有良好的选择性，但为使离子化过程稳定重现，样品净化的好坏直接影响到结果的重现性。本研究中，在萃取之前将水解衍生后的样液过滤后再萃取，其回收率很低。试验中曾将调好pH值的试剂添加溶液直接过 Oasis HLB，分别用氨水、甲醇、乙酸乙酯等洗脱发现其回收率偏低 (表 3)。

由表3可知，采用固相萃取尚未找到合适的条件，有待于进一步研究。因此，以乙酸乙酯为提取剂，采用液-液萃取模式，是非常有效的，同时还可以提高浓缩倍数，降低最小检测限 (LOD)。

2.3 LC-MS-MS条件的优化

HPLC条件的优化。使用inertsil:ODS-3色谱柱，以0.1%甲酸溶液和乙腈作为流动相，做梯度洗脱，流速为0.3 mL·min-1，对目标化合物可获得很好的分离。硝基呋喃代谢物的保留时间见表4。硝基呋喃衍生物标准品的提取离子流详见图1。

质谱条件的优化。由于硝基呋喃类抗生素代谢物为强极性物质，含有电负性强的原子，因此用TurboIonSpray®离子源，正离子方式，先用Q1全扫描，找出准确的M+1峰，然后分别以此为母离子，通过改变碰撞电压进行轰击，找出2～3个信号较强的碎片离子，以母离子与子离子组成监测离子对，以多反应检测 (multiple reaction monitor，MRM)对待测物进行定性和定量分析，同时优化质谱条件。观测了不同质谱参数 (喷雾电压、碰撞电压等)对测定结果的影响，结果表明，随着喷雾电压的增大，硝基呋喃类代谢物的衍生物的信号响应值逐渐增大，当喷雾电压为5.5 k V时达到最大值，随后趋于平缓。通过对每种硝基呋喃代谢物衍生物的碰撞能量优化，碰撞电压在15～32 V范围内，分子离子峰 ［M+1］断裂产生特征性碎片离子。

表3 试剂添加过HLB固相萃取小柱的情况

表4 硝基呋喃代谢物的保留时间

图1 硝基呋喃衍生物标准品的提取离子流

2.4 线性方程和检测限

由实验可知，硝基呋喃4种代谢物在1～10 μg·kg-1内线性良好，相关系数均大于0.998 2，符合仪器分析方法的要求 (表5)。

2.5 回收率和精密度

方法的检出限理论上为被测物质丰度较弱子离子的信号/噪声比 (S/N)≥3，在此前提下通过向阴性样品中添加标准物质，外标法计算，称样量和进样量来验证方法的回收率。4种代谢物回收率在83.5% ～95.7%(表6)，相对标准偏差小于7.3%(表7)。呋喃唑酮，呋喃它酮，呋喃西林，呋喃妥因的检出限定为 0.5 μg·kg-1。

表5 硝基呋喃4种代谢物的回归方程和相关系数

表6 蜂蜜中添加4种代谢物的回收率

表7 测定结果的精密度

3 小结

本研究采用代谢物水解与衍生化同步进行，液液萃取净化，液相色谱串联质谱检测，多重反应监测，外标法定量，成功地测定了出口蜂蜜中硝基呋喃类抗生素代谢物。标准曲线线性良好，定量限、检测限均达到比较满意的结果，可以满足目前对进出口蜂蜜的检测要求。

［1］ 彭涛，邱月明，李淑娟，等.高效液相色谱-串联质谱法测定动物肌肉中硝基呋喃类抗生素代谢物 ［J］.检验检疫科学，2003，13(6):23-25，28.

［2］ 彭涛，储晓刚，杨强，等.高效液相色谱/串联质谱法测定奶粉中的硝基呋喃代谢物 ［J］.分析化学研究报告，2005，33(8):1073-1076.

［3］ 郭德华，汪国权，王东辉，等.高效液相色谱-串联质谱法测定动物源性食品中硝基呋喃类代谢物残留量 ［J］.分析测试学报，2005，14(4):167-18.

［4］ Bernhard W，Christian S，Hans(J)A R.安捷伦液相/离子阱 (XCT)质谱检测虾仁及家禽中的硝基呋喃代谢物 ［J］.环境化学，2004，23(6):717-721.