丙氨酸氨基转移酶37℃参考方法评价临床常用方法探讨

齐志宏,张 芳,赵 芳,邸 茜,宋耀虹,苏玉君,嵇 巍,谢少伟

(中国医学科学院北京协和医院检验科,北京100730)

丙氨酸氨基转移酶(ALT)作为临床常用实验诊断指标,对肝脏疾病的诊断和疗效监测有十分重要的作用。目前,酶测定主要是通过它们催化的反应速度测定的,以酶催化(活性)浓度表示。但由于酶的催化活性不仅决定于酶的含量,还受底物浓度、反应介质的pH、温度、离子强度、激活或抑制因子等多种因素的影响。因此同一酶测定存在多种参考范围,各实验室间的结果缺乏可比性,甚至有时会引起临床上的误诊。国内各临床实验室间测定酶活性结果的差异较大,明显高于小分子化合物的测定结果[1]。

本研究旨在依据国际临床化学与检验医学联合会(IFCC)参考测量程序,建立ALT 37℃参考方法,以此评价Vitros干化学系统和4种检测组合的湿化学系统,探讨血清ALT测定结果的准确性与可比性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 Olympus AU 2700全自动生化分析仪;Vitros 250干化学全自动分析仪;SHIMADZU UV-1700紫外可见分光光度计;SHIMADZU TCC比色杯恒温电子控制装置;CAL 3200点温度计;Fisher Scientific Accumet model 10 pH计;Sartorius RC210D分析天平;Eppendorf加样器(Research);华恒万仪水浴箱;秒表。

1.1.2 试剂 (1)建立参考方法所用试剂:丙酮酸钠(纯度 99%);L-丙氨酸(纯度 98%);α-酮戊二酸(纯度 97%,无水);β-尼克酰氨腺嘌呤二核苷酸(NADH)还原型(纯度98%);磷酸吡哆醛(PLP)(纯度98%);氯化钠(纯度99.5%);Tris(纯度99.9%);牛血清白蛋白(BSA)组分V(纯度96%);盐酸1N(分析纯);氢氧化钠5M(分析纯),以上试剂均为Sigma公司提供。叠氮钠(纯度99.0%)由Farco提供。乳酸脱氢酶(LDH)甘油溶液,LDH活性超过6000 KU/L;由Roche公司提供。实验用水为去离子水,电导率大于18.0兆欧。(2)干化学用试剂:Vitros 250配套ALT试剂(批号6231-3902)、校准品和质控品。(3)湿化学用试剂:Roche加入磷酸吡哆醛的ALT试剂(批号681952-01)、Roche c.f.a.s校准品;Olympus未加入磷酸吡哆醛的ALT试剂(批号4572)、Olympus校准品;2个水平的Randox质控血清。(4)酶校准品的制备:收集新鲜病人血清5ml,加入0.1%叠氮钠,混匀分装成5份,-80℃密封保存。

1.1.3 样品:(1)ERM○R-AD 454 ALT参考品:由 IRMM/IFCC提供附有证书的参考物质,使用方法见说明书。(2)按照NCCLS EP9-A文件收集40份ALT浓度从5-270 U/L的新鲜病人血清,每份新鲜血清量至少1 ml以上。放-80℃保存。

1.2 方法

1.2.1 建立ALT参考方法 具体操作及反应和测量条件见IFCC提供的ALT(37℃)参考测量程序[2]。

1.2.2 精密度评价 取高、低值2个不同水平的Randox质控血清,每天测定2次(2次间隔不少于2 h),每次测定均做双份,连续测定20 d,按NCCLS EP5-A文件进行评价。

1.2.3 测定ERM○R-AD 454 ALT参考品 严格按照要求溶解ERM○R-AD 454 ALT参考品,用参考方法测定。

1.2.4 酶校准品定值 用参考方法对制备的酶校准品进行准确定值。

1.2.5 评价常用试剂 (1)Vitros 250 ALT组成配套检测系统。(2)Olymous 2700组成3份非配套系统和1份配套系统,见表1。表1的5种检测系统与参考方法同时测定40份人血清。参考方法编码为A。

表1 常用方法检测系统组成

1.3 统计学分析

使用SPSS软件和Excell对数据进行处理。

2 结果

2.1 参考方法的精密度 利用EP5-A可以对批内、批间、日间及总精密度进行计算,高低质控批内CV 0.21%-0.62%;批间 CV 0.24%-0.68%;日间 CV 0.35%-0.77%;总 CV 0.89%-1.12%。

2.2 测定 ERM○R-AD 454 ALT参考品 测定3次的结果分别为 186.9、186.2、186.0 U/L。均值 186.4 U/L,在ERM给定的186±4 U/L范围内。

2.3 酶校准品定值 用参考方法测定5瓶制备的酶校准品,结果分别为 100.1、100.0、100.2、100.1、100.1 U/L,计算其平均值为100.1 U/L。

2.4 评价检测系统 从方法A-F分别测定40份血清ALT,B、C、D、E、F常用方法ALT结果分别与参考方法A做相关。B与A方法的相关方程:y=0.9394x-0.0261,r2=0.994;C与A方法的相关方程:y=0.9088x-1.1733,r2=0.998 6;D与A方法的相关方程:y=0.9342x+0.1767,r2=1;E与A方法的相关方程:y=0.949x-7.1571,r2=0.997;F与A方法的相关方程:y=1.0013x-7.4914,r2=0.998。从上述结果可以看出,常用方法B、C、D、E、F均与参考方法密切相关。

图1 B常用方法ALT结果与参考方法偏差

图2 C常用方法ALT结果与参考方法偏差

B、C 、D、E、F 常用方法 ALT 结果与参考方法偏差,见图1-5。从图1-3可以看出,常用方法B、C与参考方法的偏差均在±20%之内,D与参考方法偏差在±10%之内。可以满足CLIA',88的评判标准。常用方法B、C、D测定ALT结果与参考方法可比。从图4-5可以看出,常用方法E和F与参考方法ALT结果的偏差在低ALT结果时高达60%。远高于CLIA'88的20%的标准,与参考方法可比性差。

图3 D常用方法ALT结果与参考方法偏差

图4 E常用方法ALT结果与参考方法偏差

图5 F常用方法ALT与参考方法偏差

3 讨论

酶催化活性测定结果缺乏可比性的问题由来已久。为了提高酶测定实验的准确性和精密度,使酶测定结果在方法上,实验室间有可比性,开展酶测定的标准化工作势在必行。近20年来,国内外主要从三个方面开展了酶测定的标准化活动:一是提出使用参考测量程序(参考方法);二是用参考方法定值的酶参考物去校准常规方法;三是建立参考实验室网络。目前,根据临床检验实验室管理办法及对检测实验室能力的通用要求[3],对实验室检验结果的可溯源性提出了明确的要求。临床化学检测中使用的仪器、试剂、校准品和操作方法等组合成一定的检测系统。检测系统的不配套是造成测定结果溯源性低、可比性差的一个重要原因。对酶活性测定进行标准化可以解决这一问题[4]。其有效手段是通过参考方法和参考物做支持,为具有可转换性的酶校准品赋值,再用这种经过赋值的校准品对多种常规测定方法进行校准,从而提高测定的溯源性和不同检测系统间的可比性[1,5]。

本研究依据IFCC推荐方法建立了ALT参考方法,是为了评价临床常用ALT检测方法,探讨不同检测系统ALT结果的可比性。因为参考方法是手工操作,程序繁琐而费时,仅有IFCC的标准化操作规程是不够的。为了提高实验的精密度,必须将操作程序细化,从试剂的温预时间,加样方法以及反应温度的控制,搅拌方式等保持操作的一致性,可以减小CV。通过摸索,本实验的高值质控总CV0.89%;低值质控总 CV 1.12%。本实验通过测定ERM○RAD 454 ALT参考品进行了准确性验证。同时我们2007年国际RELA ALT回报结果在十几家参考实验室的靶值上,本室建立的ALT参考方法准确可靠。

本实验通过Vitros干化学配套系统,Olympus仪器和Roche试剂及校准品组成的湿化学非配套系统;Olympus仪器和Roche试剂及参考方法定值的冰冻血清组成的湿化学非配套系统;Olympus湿化学配套系统以及Olympus仪器试剂和Roche组成的湿化学非配套系统ALT五种检测结果和参考方法进行比较,发现这五种组合的常用检测系统与参考方法相关良好。这可能由于这五种检测方法和参考方法的反应原理相同的缘故。但是这五种检测组合与参考方法的百分偏差却有很大的区别。从本实验结果看,与参考方法可比性从好到差的顺序如下:即D,B;C,F和E常用方法相差不多。前三种常用检测组合与参考方法的可比性符合CLIA',88的标准,可以接受。在前三种组合中,可比性最好的是D即用参考方法定值校准的常用方法,其次是B即Vittos干化学系统,最后是C即c.f.a.s校准的非配套湿化学组合。这可能因为D是参考方法给新鲜血清定值避免了基质效应,而B是可以溯源到IFCC原级参考方法的配套体系,C虽然不是配套体系,由于是Roche试剂和c.f.a.s校准品的组合,而c.f.a.s通常被认为参考方法的二级参考物。C也可以被认为能够溯源到IFCC原级参考方法。F和E常规检测组合与参考方法可比性差,导致这两种常用检测组合无法溯源到IFCC参考系统。最主要的原因在于参考方法检测体系中加入了磷酸吡哆醛(PLP),而F和E检测系统中没有加入PLP。PLP是ALT的辅基,通过酶蛋白中磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺的互变促使氨基酸的氨基和酮酸的酮基进行转化。没有酶活性的脱辅基酶蛋白,在加入PLP后将变为有活性的全酶。IFCC认为应在ALT反应前加入足量的PLP测定血清中全部ALT酶的活性。由于我国长期以来试剂中均不加入PLP,对这个问题一直没有引起足够重视。随着与IFCC接轨,加PLP试剂增多,两种试剂差异的问题日益突出。从本实验结果可以看出,检测体系中是否加入PLP对ALT结果存在影响,从而影响了ALT结果的可比性。因此笔者认为单依靠建立IFCC的ALT的参考方法,仍然无法解决ALT可比性的问题。或者可以考虑在常规检测系统中加入磷酸吡哆醛,或者建立不加磷酸吡哆醛的ALT参考方法,需要临床化学检验专家达成共识。

[1]张克坚,杨振华.临床酶学标准化的新途径[J].中华医学检验杂志,1999,22(1):54.

[2]Schumann G,Bonora R,Ceriotti F,et al.IFCC primary reference procedures for the measurement of catalytic activity concentrations of enzymes at 37 degrees C.International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine.Part 4.Reference procedure for the measurement of catalytic concentration of alanine aminotransferase[J].Clin Chem Lab Med,2002,40(7):718.

[3]杨振华.中华医学会检验学会酶活性浓度测定的推荐方法,测定人血清(血浆)中酶活性浓度方法总则(草案)[J].中华医学检验杂志,1994,2:121.

[4]杨振华.建立参考系统是当务之急[J].中国临床实验室,2003,4:11.

[5]Franzini C,Ceriotti F.Impact of reference materials on accuracy in clinical chemistry[J].Clin Biochem,1998,31:449.