结核分枝杆菌重组Mtb81蛋白抗原血清学诊断价值的研究

阳幼荣 吴雪琼 张俊仙 梁艳 张翠英 董梅 陈红兵 何菊芳

(解放军第309医院结核病研究室 北京 100091)

结核分枝杆菌重组Mtb81蛋白抗原血清学诊断价值的研究

阳幼荣 吴雪琼 张俊仙 梁艳 张翠英 董梅 陈红兵 何菊芳

(解放军第309医院结核病研究室 北京 100091)

目的研究重组Mtb81(rMtb81)蛋白的抗原性,评价其在结核病血清学诊断中的价值,寻找更有效的结核病诊断试剂>。方法应用基因工程技术表达、纯化rMtb81蛋白,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测192名健康者和210例肺结核患者血清中抗结核抗体>。结果rMtb81蛋白在大肠埃希菌细胞内以包涵体形式高效表达,表达量占菌体总蛋白的30%左右,相对分子量约80.7 kD,具有良好的抗原特异性。在210例结核病患者血清中,103例菌阳患者和107例菌阴患者抗rMtb81抗体的阳性率分别为37.9%和41.1%,总的灵敏度为39.5%。在192例正常人血清中,95例PPD阴性者和 97例PPD阳性者抗 Mtb81抗体的阳性率分别为 1.1%和 6.2%。结论rMtb81蛋白可能成为结核病血清学诊断的组合抗原之一。

血清学试验;分枝杆菌,结核;重组蛋白质类;细菌蛋白质类;抗原,细菌

目前结核病是危胁发展中国家的重要疾病之一,随着 HIV的蔓延,结核病疫情也越来越严峻。早期诊断、有效治疗是结核病疫情控制的重要手段,目前血清学诊断方法已成为结核病重要的辅助诊断手段,许多重组结核分枝杆菌抗原已被用于快速血清学诊断试验或已被评价[1-3],研究发现结核分枝杆菌rMtb81蛋白抗原在HIV合并感染的结核患者的血清学检测中能与其他重组蛋白形成较强的互补性[4]。本文应用基因工程技术表达、纯化结核分枝杆菌rMtb81蛋白,并通过ELISA方法研究结核病患者血清与纯化的rMtb81的抗体反应,评价rMtb81抗原在结核病免疫反应中的作用及其在结核病血清学诊断中的价值,寻找更有效的结核病血清学诊断组合抗原。

1 材料和方法

1.1 菌种和血清来源 pET24b-Mtb81大肠埃希菌工程菌由本课题组构建[5]。210例结核病患者血清来自全军结核病研究所已确诊为肺结核病的住院患者。192例正常人血清来自2007年入伍新战士的体检血清。

1.2 Mtb81基因的诱导表达 将pET24b-Mtb81大肠埃希菌工程菌接种于含硫酸卡那霉素50 μ g/ml的LB液体培养基中,37℃培养至A600=0.8左右时,诱导表达4 h收集菌体。

1.3 SDS-PAGE SDS-PAGE电泳鉴定rMtb81的表达水平。将菌体悬浮于适量的1×SDS凝胶载样缓冲液中,置沸水浴中5～10min,离心后取上清,加于4.5%浓缩胶和12%分离胶中进行SDS-PAGE电泳。凝胶经考马斯亮蓝G-250染色和甲醇/冰醋酸脱色后,观察结果并照相保存。

1.4 菌体破碎和包涵体提取 诱导后的pET24b-Mtb81大肠埃希菌工程菌按《分子克隆实验指南》[6]介绍的方法提取包涵体,取部分上清液和包涵体沉淀进行SDS-PAGE分析,以确定Mtb81在大肠埃希菌中的表达形式。

1.5 重组蛋白的回收、纯化及含量测定 采用Novagen公司生产的His.Bind蛋白纯化试剂盒纯化rMtb81蛋白,按试剂盒说明书介绍的操作步骤进行。通过Lowry法[7]测定蛋白含量,除菌过滤后置-20℃贮存备用。

1.6 应用ELISA方法检测血清中抗结核抗体 将结核分枝杆菌纯化的rMtb81蛋白(10 μ g/ml)包被于美国Costar 96孔酶标板上,4℃过夜;用PBST洗液洗涤3次;加入1∶100倍稀释的待检血清,37℃温育 1 h;用 PBST洗液洗涤 3次;加入1∶10 000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG,37℃温育1 h;再用PBST洗液洗涤3次;加入邻苯二胺和H2O2底物显色30 min,以2 mol/L硫酸终止反应。以空白对照调校零点,用酶联免疫检测仪测定492 nm的OD值,取2孔平均值作为终结果。

1.7 统计学分析 采用SPSS18.0软件进行统计学分析,所有结果均用¯x±s表示,正常人群组与结核病人组间比较采用Kruskal-Wallis U检验。

2 结果

2.1 rMtb81蛋白的纯化 pET24b-Mtb81重组质粒在大肠埃希菌中经IPTG诱导4 h后,通过SDSPAGE分析可见特异的表达产物带,相对分子量约为80.7 kD左右,光密度扫描分析表明占菌体总蛋白30%左右。将诱导菌超声破碎后的上清液和沉淀部分分别进行SDS-PAGE分析,沉淀部分可见较明显的特异蛋白表达带,而上清液中未见特异蛋白表达带,说明表达的rMtb81蛋白大多以细胞内不溶性包涵体的形式存在。应用His.Bind蛋白纯化试剂盒在变性条件下纯化rMtb81蛋白,纯化后的样品经SDS-PAGE分析显示只见1条回收的蛋白带(图1),未见其他杂带,经光密度扫描分析表明其纯度约为95%左右。

图1 rM tb81蛋白的SDS-PAGE分析

图2 肺结核组与正常人组中抗M tb81抗体OD值

表1 结核病人组与正常人组中抗Mtb81抗体检测结果

2.2 人血清中抗结核抗体的检测 肺结核组与正常人组中抗Mtb81抗体OD值如下图：

肺结核组与正常人组中抗Mtb81抗体OD值差异有统计学意义(P＜0.05),以192例正常对照的光密度平均值+2倍标准差(0.22)为正常界限值,检测结果如下表。

3 讨论

近年来的研究[8]发现Mtb81蛋白是由结核分枝杆菌glcB(即Rv1837c)基因编码的苹果酸合酶,相对其分子量为88 kD,存在于结核分枝杆菌培养滤液中,在结核合并HIV感染的患者中具有重要的血清学诊断价值。本文通过基因工程技术高效表达、纯化 rMtb81蛋白抗原,其相对分子量为80.7 kD。通过ELISA方法检测95例PPD阴性的正常人血清仅1例为阳性,阳性率为1.1%,97例PPD阳性的正常人血清中6例为阳性,阳性率为6.2%,说明结核菌潜伏感染者或卡介苗接种者血清中也存在一定的结核菌抗原刺激机体产生低水平的抗体。在103例涂片阳性患者血清标本和107例涂片阴性患者血清标本中,rMtb81蛋白抗原在涂片阴性患者标本中的灵敏度高于涂片阳性患者标本。这与 Chaudhary等[9]的报道一致,他们发现重组Mtb81在检测涂片阳性标本时与重组38 kD的灵敏度差异无统计学意义,但检测涂片阴性血清标本时的灵敏度比重组38 kD高出50%。国内有文献报道rMtb81的特异性和灵敏度可达96%、93%[10],可能由于患者标本选择差异所致。

总之,不同结核病患者可能对不同的结核分枝杆菌抗原产生抗体。结核分枝杆菌Mtb81蛋白能刺激机体产生特异性抗体,可与其他结核分枝杆菌抗原形成互补,提高结核病患者的阳性检出率。我们将进一步研究rMtb81抗原与其他抗原联合检测抗结核抗体的临床意义。

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Serodiagnostic value of recombinant Mtb81 protein from M.tuberculosis for tuberculosis

Yang Yourong,Wu Xueqiong,Zhang Junxian,Liang Y an,Zhang Cuiying,Dong Mei,Chen Hongbing,He Jufang
Institute of Tuberculosis Research,The309th Hospital of PLA,Beijing100091,China

serologic tests;Mycobacteriu m tuberculosis;recombinant proteins;bacterial proteins;antigens,bacterial

Wu Xueqiong(wu-xueqiong@263.net)

吴雪琼(wu-xueqiong@263.net)

北京市科技计划研发攻关类科研基金资助项目(D08050700640802)和国家重大传染病防治科技重大专项基金资助项目(2008ZX100 03-001)

Objective To evaluate the value of recombinant Mtb81(rMTB81)protein fromM.tuberculosison the serodiagnosis of tuberculosis(TB),and to develop more effective diagnostic reagents for TB.MethodsThe rMTB81 protein was expressed and purified by metal chelation chromatography.The antibody IgG againstM.tuberculosisrMtb81 antigen in 402 human sera were detected by ELISA.ResultsThe rMTB81 protein existed in inclusion bodies of E.coli,and amounted to 30%of total bacterial proteins.Its molecular weight was estimated about 80.7 kilodalton.Of 210 sera from TB patients,the sensitivities of antibody detection using rMTB81 protein were 37.86%in 103 bacterium-positive TB patients and 41.12%in 107 bacterium-negative TB patients.The overall sensitivity was 39.52%.Of 192 healthy subjects,their specificities of antibody detection using rMtb81 protein were 1.05%and 6.19%,respectively.The overall specificity was 3.65%.ConclusionsThe rMtb81 protein might be used as one of multiple antigens in the serodiagnosis of TB.

2009-4-21)

(本文编辑：张晓进)