辽宁地区斑秃患者与HLA-A、HLA-B等位基因相关性研究

姜海燕，翟宁，李剑平，陈阳，秦玉孝，张悦，程岩峰，杨帆，韩秀萍

（1.中国医科大学 附属盛京医院皮肤科，沈阳 110004；2.中国医科大学 附属第一医院皮肤科，沈阳 110001；3.辽宁省血液中心，沈阳110044；4.铁岭市中心血站，辽宁 铁岭 112000）

斑秃是一种常见的毛发疾病，发病原因尚不清楚，目前认为可能与遗传，情绪应激，内分泌失调，自身免疫等因素有关，其中遗传因素可能起重要作用［1］。关于HLA-A、HLA-B等位基因与斑秃的相关性研究，国外报道较多，国内少有此方面的报道。关于此方面的报道因种族不同，地域不同而有差异。为了探讨HLA-A、HLA-B等位基因与辽宁地区斑秃患者的相关性，我们应用LABTypeTMSSO技术（又称序列微珠综合实验系统）检测了44例辽宁地区汉族斑秃患者和200例正常对照者的HLA-A、HLA-B等位基因频率。

1 材料与方法

1.1 研究对象

斑秃患者44例，其中男性26例，女性18例，年

龄 3~57岁，平均（25.36±13.23）岁，病程 5 d~86个月，均为中国医科大学附属盛京医院皮肤性病门诊确诊的辽宁地区汉族斑秃患者，彼此间无血缘关系。正常对照组200例，为彼此间无血缘关系的辽宁籍汉族健康人。

1.2 血液采集与实验方法

1.2.1 基因组DNA的制备：静脉抽取受检者抗凝血2 ml，其中0.5 ml用于DNA制备，其余血液分装每管0.5 ml后-80℃冷冻保存备用。应用全血基因组DNA提取试剂盒（大连宝生物工程有限公司产品）提取基因组DNA。严格按说明书进行实验操作。（1）取EDTA抗凝血0.5 ml至1.5 ml离心管中，加入GenTLE SolutionⅠ0.5 ml，震荡数秒后室温放置10 min，12 000 r/min，离心 5 min。（2）除去溶液，加入GenTLE Solution Ⅱ 1ml，颠倒混合 2、3 次后，12 000 r/min离心 5 min。（3）除去上清，加入 GenTLESolution Ⅲ 0.5 ml，震荡 10 s，12 000 r/min 离心 5 min。（4）将上清液移入新的离心管中，与等量的异丙醇混合，充分颠倒混合后，12 000 r/min 4℃离心5 min；（5）除去上清，70%乙醇清洗沉淀物，12 000 r/min 4℃离心5 min后干燥沉淀，用10μl TEBuffer溶解沉淀。（6）纯化DNA。将制备的DNA浓度调为0.1μg/μl左右。DNA纯度A260/A280比率在1.6~1.9。并用0.8%琼脂糖凝胶电泳显示无DNA降解现象。

1.2.2 HLA分型：HLA-A、HLA-B基因分型采用基于Luminex技术的One Lambda公司PCR-SSO试剂。严格按说明书进行实验操作。（1）等位基因扩增：准备PCR板，每孔加待测DNA 2μl，底物/组特异性引物/Taq聚合酶混合液9μl。PCR循环参数：96℃预变性3 min，96℃变性 20 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，共计5个循环；96℃变性10 s，60℃退火15 s，72℃延伸20 s，共计30个循环；72℃延伸10 min。（2）变性及中和：准备96孔板，每孔加扩增后的DNA 2.5μl及变性缓冲液1.5μl，温室下孵育10 min后加中和缓冲液2.5μl。（3）杂交：每孔加杂交缓冲液（内含包被有SSO探针的磁珠，其中A位点79个探针，B位点86个探针）19μl，60℃孵育15 min后用洗涤液清洗3次。（4）标记：每孔加荧光液25μl，60℃孵育5 min后用洗涤液清洗1次，加60 μl洗涤液，转到Luminex读板上。（5）读板并确定基因型：杂交产物用Luminex100流式微珠自动检测仪进行结果读取和分析（流式分析仪，Luminex公司产品），确定基因型。

1.3 统计学方法

应用SPSS17.0软件分析，采用卡方检验对患者组和正常对照组的HLA等位基因进行相关性分析，获得χ2值及P值。

2 结果

2.1 斑秃患者组与正常对照组HLA-A等位基因频率比较

斑秃患者组HLA-A*11等位基因频率较正常对照组明显增高（10.23%vs 4.00%，χ2=6.08，P=0.01），见表1。

表1 HLA-A等位基因在患者组与对照组中的频率比较Tab.1 The comparison of HLA-A allele frequencies between the patients with alopecia areata and healthy control

2.2 斑秃患者组与正常对照组HLA-B等位基因频率比较

斑秃患者组HLA-B*13（12.50%vs 1.25%，χ2=29.80，P=0.00）、HLA-B*40 （12.50%vs 4.75%，χ2=8.04，P=0.01）、HLA-B*46（5.68%vs 1.50%，χ2=5.86，P=0.02）和 HLA-B*51（12.50%vs 4.50%，χ2=8.82，P=0.00）等位基因频率均较正常对照组显著增高，见表2。

3 讨论

斑秃的病因至今未明。大多数观点认为它是细胞介导、基因调控的自身免疫性疾病。基因易患性似乎是一个病因，有人认为斑秃可能与HLA基因相关［2］。关于斑秃与HLA相关性研究，国外在此方面的研究比较早。Kavak［3］报道土耳其斑秃患者HLAA1、HLA-B 62（15）等位基因频率明显增高。Aliaqaoqlu［4］研究发现土耳其斑秃患者HLA-B 62显著增多，而 HLA-A*2、HLA-A*24、HLA-B*35 明显减少，提示 HLA-A*2、HLA-A*24、HLA-B*35 可能是斑秃患者的保护性基因。McDonagh［5］报道以色列人与HLA-B18 相关。Hordinsk［6］和 Nanda［7］分别报道美国和科威特斑秃患者HLA-B*40等位基因频率明显增高，这与我们的研究结果相一致。

关于斑秃与HLA-A、HLA-B等位基因的相关性，国内外的检测结果不尽相同。国内在此方面的研究多选择不同省籍的汉族斑秃患者作为研究对象。2007年肖凤丽等［8］发现皖籍汉族斑秃患者HLAA*02、HLA-A*03、HLA-B*18、HLA-B*27 和 HLA-B*52等位基因频率较正常对照组显著增高。其结果与国外报道部分相同，而与我们的结果无相同之处。

表2 HLA-B等位基因在患者组与对照组中的频率比较Tab.2 The comparison of HLA-B allele frequencies between the patients with alopecia areata and healthy control

我 们 研 究 发 现 HLA-A*11、HLA-B*13、HLAB*40、HLA-B*46和HLA-B*51等位基因频率显著增 高 。HLA-A*11、HLA-B*13、HLA-B*46 和 HLAB*51是我们新发现的易患基因位点，可能是辽宁地区汉族斑秃患者的易感基因。我们的研究结果与以往的研究有相同之处，说明遗传因素可能在斑秃的发病中起重要作用，而有差异则考虑可能是地域不同、种族不同所致。通过对斑秃患者与HLA-A、HLAB等位基因相关性的研究，将对揭示斑秃的发病机理及临床早期诊断具有重要意义。

［1］Kos L，Conlon J.Anupdateon alopeciaareata［J］.Curr Opin Pediatr，2009，21（4）：475-480.

［2］Richard B.Odom，William D.James.Timothy G.Berger.安德鲁斯皮肤病学［M］.9版，北京：科学出版社，2001：943-945.

［3］Kavak A，Baykal C，Ozarmagan G，et al.HLA in alopecia areata［J］.Int JDermatol，2000，39（8）：589-592.

［4］Aliaqaoqlu C，Pirim I，Atasoy M，et al.Association between alopecia areataand HLAclassIand Turkey［J］.JDermatol，2005，32（9）：711-714.

［5］McDonagh AJ，Messenger AG.The Pathogenesis of alopecia areata［J］.Dermatol Clin，1996，14（4）：661-670.

［6］Hordinsky MK，Hallgren H，Nelson D，et al.Familial alopecia areata HLAantigensand autoantibody formation in an American family［J］.Arch Dermatol，1984，120（4）：464-468.

［7］Nanda A，Alsaleh QA，Al-Hasawi F，et al.Thyroid functi-on，autoantibodies，and HLA tissue typing in children with alopecia areata［J］.Pediatr Dermatol，2002，19（6）：486-491.

［8］肖风丽，苗国英，张克西，等HLA等位基因与皖籍汉族人群斑秃的相关性研究［J］.安徽医科大学学报，2007，42（1）：67-69.