血管紧张素Ⅱ受体抑制剂对雌激素诱导的Ishikawa细胞的增殖及凋亡的影响

苏卿，杨清

（中国医科大学 附属盛京医院第一微创妇科，沈阳 110004）

肥胖、高血压、糖尿病是子宫内膜癌的高危因素，被称为“宫体癌综合征”。而肥胖、高血压和糖尿病患者体内的血管紧张素Ⅱ水平及雌激素水平均较高，所以我们选择saralasin（沙拉新，血管紧张素Ⅱ抑制剂）来阻断，探讨血管紧张素Ⅱ受体在子宫内膜癌中的作用。本研究应用四甲基亚唑蓝（MTT）和流式细胞技术观察saralasin对雌激素作用下的子宫内膜癌细胞的增殖、凋亡和细胞周期的影响。

1 材料

1.1 细胞系

人子宫内膜癌ishikawa细胞系来源日本大学妇产科实验室馈赠，经检测雌激素受体和孕激素受体表达均阳性。

1.2 试剂

水溶性17β-雌激素、saralasin、四甲基亚唑蓝（MTT）和碘化丙啶（PI）购自美国sigma公司，兔抗人AT1-R购于博奥森生物公司，AT1-R山羊抗兔TITC标记荧光抗体购于北京中杉生物公司，AnnexinⅤ-TITC试剂盒购于晶美生物公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：ishikawa细胞培养于含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养液中，于37℃、体积分数5%ml/L的CO2孵育箱中培养贴壁生长，取对数生长期的细胞用于实验。

1.2.2 免疫荧光技术：检测AT1-R在ishikawa细胞的表达，以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.2.3 细胞增殖率的测定：应用MTT的方法，设立调零孔及等量含有相同浓度的DMSO的DMEM培养液作为阴性对照，试验孔中加入雌激素浓度分别为 10-6、10-8、10-10、10-12mol/l，每列设 5 复孔。于加药后30 min后终止反应，测吸光度（A）值。同理，确定雌激素浓度后我选择 5、10、15、30、60 和 120 min 测其作用时间；测saralasin的作用浓度和各实验组不同时间的增殖率，实验重复3次，增殖率或抑制率=（实验组-对照组）/（对照组-空白组）。

1.2.4 细胞周期的测定：实验分分3组，第1瓶加入含10%胎牛血清的DMEM培养液4ml。第2瓶加入雌激素浓度为10-8mol/l的DMEM培养液4 ml，第3瓶加入含雌激素浓度为10-8mol/l和saralasin浓度为10-6mol/l的DMEM培养液4 ml，分别于加药后10 min终止反应，取1×106个细胞打入预冷的5 ml 70%的乙醇中，封口膜封口，4℃固定过夜，加入RNase-A 3 ul至浓度为 50 ug/ml，37℃水浴消化 30 min，加PI76 ul至浓度约为100 ug/ml，在冰浴中避光染色30 min。流式细胞仪上计数细胞，采用细胞周期分析软件处理。

1.2.5 细胞凋亡的检测：采用AnnexinⅤ/PI双染色法，各组加入处理因素，作用10 min后，按照试剂盒操作步骤收集细胞、处理样本，立即上机检测。

1.2.6 统计学处理：采用SPSS13.0统计软件进行分析，实验数据以x±s表示，分析采用方差分析，组间比较用LSD法，P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫荧光结果

用AT1-R抗体做免疫荧光实验在荧光显微镜下观察，结果如下可见实验组细胞膜和细胞质染成绿色，呈阳性表达，核染成蓝色。阴性对照组细胞不着色。（图1）

2.2 MTT实验结果

2.2.1 雌激素对ishikawa细胞增殖影响：各种浓度的雌激素 （10-12mol/L，10-10mol/L，10-8mol/L，10-6mol/L，10-4mol/L）促增殖作用比较，以10-8mol/L作用最强，所以以后试验组以雌激素浓度为10-8mol/L作为诱导浓度；测 5 min、10 min、15 min、30 min、60 min和120 min雌激素对ishikawa细胞的促增殖作用，以30 min作用最强。雌激素对ishikawa细胞具有促进细胞增殖的作用，具有剂量依赖性和时间依赖性。

2.2.2 saralasin对ishikawa细胞增殖的影响：saralasin对ishikawa细胞的抑制作用具有浓度依赖性。随着 saralasin 浓度 10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L的增加其对ishikawa细胞的抑制率36.30%、25.34%、19.29%也增加。

2.2.3 saralasin对不同时间雌激素诱导的ishikawa细胞增殖的影响（表1）：以上数据中根据先期试验先确定了雌激素的诱导浓度10-8mol/L和saralasin的浓度10-6mol/L，然后发现saralasin在5 min时已经开始起抑制作用，在雌激素诱导下，不同时间各组间只有10min组与对照组比有统计学意义（P<0.05）。因此我们后续实验采用10 min，来研究细胞周期和凋亡。

表1 saralasin对雌激素诱导不同时间下ishikawa细胞增殖的作用Tab.1 The effect of saralsin on the proliferation of ishikawa induced by estrogen

2.3 细胞周期实验结果

流式细胞仪检测细胞周期结果见图2：雌激素组G0/G1期减少，S期增多；saralasin组G0/G1期增多，S期减少，这提示saralasin使雌激素诱导10 min的ishikawa细胞发生了G0/G1阻滞，抑制了细胞生长。各组间差异有统计学意义（P<0.05）。

2.4 细胞凋亡实验结果

各组细胞经AnnexinⅤ/PI染色，流式细胞仪检测结果如图3所示，saralasin能在10 min使雌激素诱导的ishikawa细胞发生凋亡，正常对照组细胞早期凋亡率为9.54%，雌激素组细胞早期凋亡率6.87%，saralasin组细胞早期凋亡率为13.19%，各组间差异有统计学意义（P<0.01）；晚期凋亡率和坏死率正常对照组为4.13%，雌激素组为4.79%，saralasin组为8.54%，各组间差异有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

3.1 雌激素对子宫内膜癌ishikawa细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的作用

目前研究认为雌激素有转录和非转录两种效应，都是通过与其受体结合实现的，也有学者［1］认为雌激素与其受体结合后上述两种效应协同发挥作用，促进细胞增殖。本实验研究结果显示，雌激素能够促进ishikawa细胞增殖，且具有时间和浓度依赖性，在2 h内其刺激增殖作用以30min最强；使ishikawa细胞G1期下降，S期升高。雌激素能使子宫内膜癌ishikawa细胞周期中G1期比例下降，S期比例增高，可见雌激素能诱导细胞的DNA合成增多，加快细胞G1期到S期的过渡，导致细胞的过度增殖。在30 min促进增殖作用最强，说明其刺激增殖作用主要是通过非转录效应实现的。在雌激素作用10 min后凋亡结果显示，雌激素能使细胞的凋亡受到抑制，说明可能存在快速抑制凋亡的途径。

3.2 Saralasin对子宫内膜癌ishikawa细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的作用

Saralasin是竞争性肽类AngⅡ受体抑制剂，具有在各种组织中与AngⅡ结合部位的高亲和性，不影响AngⅠ向AngⅡ转化，与其他激素受体无亲和力，可以用saralasin阻滞，说明与AngⅡ受体在细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡中的作用。

研究表明有些肿瘤携带AT1-R，且AngⅡ及AT1-R可促进血管生成和癌细胞生长［2，3］。另外，大多数实体瘤患者，当被诊断为肿瘤时，其体内的基因已有多种改变，足以对抗单一的分子靶向治疗。蛋白激酶C可以作为第二信使，可激活MAPK或PI3K/AKt信号转导途径，在肿瘤的发生、发展中起重要作用，因此我们选择性的减少蛋白激酶C的产生，对预防肿瘤的发生、发展及改善甚至其转归都可能有重要作用。AngⅡ可以作用于AT1受体激活蛋白激酶C，因此试用saralasin阻断其作用途径，来探讨其抑制MAPK或PI3K/Akt信号转导途径，进而抑制肿瘤细胞增殖的作用机制。本实验MTT结果显示，saralasin对细胞增殖有比较明显的抑制作用，且具有浓度-时间依赖性；从相对抑制率看，在10 min时有相对明显的抑制作用，说明saralasin起作用早，可能存在与雌激素类似的快速的非转录作用抑制途径，15 min作用减弱，30 min后抑制作用逐渐增强，这可能是随着雌激素的刺激增殖能力增强，saralasin的作用相对减弱，在30 min后，雌激素的作用减弱，saralasin的作用更加明显，说明此药可能在短时间内一直存在着对肿瘤细胞的抑制作用。

流式细胞仪检测细胞周期发现，saralasin阻滞ishikawa细胞于G0/G1期，细胞凋亡增加，可能通过AT1-R干扰多种细胞蛋白的功能；因此我们下一步将用siRNA方法沉默AT1-R检测周期和凋亡情况及相关蛋白的变化。

3.3 saralasin的应用前景

本研究结果显示，AT1受体竞争性抑制剂saralasin对人子宫内膜癌细胞系ishikawa的增殖有明显的抑制作用，可使细胞周期停滞G1期，并可诱导ishikawa 细胞凋亡。这与 Arrieta［4］、Yamagishi［5］等首次用AT1-R拮抗剂坎地沙坦（candesartan），4 mg/d治疗激素抵抗的前列腺癌患者，取得较好的疗效的结果比较接近。AT1受体抑制剂对子宫内膜癌细胞有抑制增殖、诱导凋亡的作用。这可能为研究子宫内膜的发病机制提供新线索，同时为子宫内膜癌的化疗提供新方向，减少化疗反应。

［1］Levin ER.Cellular functions of plasmamembrane estrogen recep tors［J］.Steroids，2002，67（6）：471-475.

［2］Egami K，Murohara T，Shimada T，et al.Role of host angiotensin Ⅱtype1receptorintumorangiogenesisandgrowth［J］.JClinInvest，2003，112（1）：67-75.

［3］吴若飞，刘景晶.血管紧张素Ⅱ受体与肿瘤关系的研究进展［J］.现代医学，2005，33（6）：414-416.

［4］Arreta O，Guevara P，Escobar E，et al.Blockageof angiotensin IItype Ireceptor decreasesthesynthesisof growth factorsand inducesapoptosisin C6 cultured cellsand C6 rat glioma［J］.Br JCancer，2005，92（7）：1247-1252.

［5］Yamagishit，Uemura H，Nakaigawa N，et al．Angiotensin Ⅱ blocker de-creases serum prostate specific antigen in hormone refractory prostatecancer［J］.JUrol，2005，173（2）：441-441.