蒲珂,李少一,马丽,高芸,刘云会
(1.中国医科大学 附属盛京医院神经外科,沈阳 110004;2.上海交通大学 医学院附属第九人民医院口腔医学院,上海 200011;3.中国医科大学 附属第一医院内分泌研究所,沈阳 110001)
髓母细胞瘤(medulloblastoma,MB)是恶性程度极高的儿童后颅窝肿瘤,呈浸润性生长,易播散转移,手术难以完全切除,预后极差[1]。基因治疗为颅内恶性肿瘤的治愈带来了希望,其中研究最广泛、最有希望的是单纯疱疹病毒腺苷激酶/更昔洛韦(herpes simplex virus-thymidine kinase/ganciclovir,HSV-tk/GCV)自杀基因系统。HSV-tk/GCV系统抗肿瘤作用的原理是在肿瘤细胞中导入腺苷激酶(thymidine kinase,TK)基因,TK基因表达的腺苷激酶可以将无毒的更昔洛韦(ganciclovir,GCV)在肿瘤局部转化为有毒的三磷酸更昔洛韦,从而发挥高效的抗肿瘤作用。该自杀基因系统毒副作用小,抗肿瘤效果强,受到了广泛关注。
TK基因介导的自杀基因治疗中还存在一种机制——“旁观者效应”:当给予更昔洛韦时,导入TK基因的“阳性细胞”周边的未导入TK基因的“阴性细胞”也会被一同杀死的现象。在“旁观者效应”存在的情况下,TK基因对肿瘤细胞的杀伤作用进一步增强。在我们以前的研究中,应用HSV-tk/GCV自杀基因系统对胶质瘤细胞系进行了较系统的研究,并且应用神经干细胞携带TK基因,对该治疗系统进行了优化,获得了很好的治疗效果[2~5]。而在好发于儿童的髓母细胞瘤中应用HSV-tk/GCV自杀基因系统的研究还未见报道。本研究联合应用全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)与 HSV-tk/GCV 系统,研究二者联合应用对人的髓母细胞瘤细胞系Daoy的杀伤作用,旨在探讨在髓母细胞瘤细胞系中应用HSV-tk/GCV自杀基因治疗可行性,并且针对ATRA对该系统中“旁观者效应”的影响进行了初步探讨。
ATRA、噻唑蓝(MTT)、G418、二甲基亚枫(DMSO)均购自Sigma公司,Polybrene购自Aldrich公司。Daoy髓母细胞瘤细胞系购自美国ATCC公司。产生复制缺陷型HSVtk逆转录病毒的PA317包装细胞由Genetic Therapy公司提供。
取对数生长期的Daoy细胞,以2×103/孔接种于96孔板,待细胞贴壁后加不同浓度的ATRA(0~1 μmol/L),每个浓度设3个复孔,每天换液1次,3 d后MTT法测细胞存活率。
取对数生长期的Daoy细胞,以50%~60%细胞密度铺于6孔板,4~6 h后更换为加入1 ml HSV-tk逆转录病毒上清和8μg/ml的Polybrene的培养液,继续培养24 h后更换为正常培养液,继续培养12 h。将转染后细胞转移至24孔板,加200μg/ml G418筛选,每3 d换液1次,筛选12 h,选取有G418抗性的细胞在以后的实验中应用。
对照组:正常Daoy细胞;实验组:Daoy-tk细胞。分别取对数生长期的两种细胞以2×103/孔密度接种于96孔板,细胞贴壁后,加不同浓度梯度的GCV(0~30μg/ml),每个浓度设3个复孔,条件培养液每2 d更换1次。第7天MTT法测细胞生存率:每孔加入5μg/ml的MTT 20μl,37℃孵育4 h,弃培养液,加入DMSO 150μl,在酶联免疫检测仪上以492 nm波长检测各孔吸光光度值(A)。细胞存活率=实验组A均值/对照组A均值×100%。
对照组:单独Daoy细胞;治疗组:Daoy-tk与Daoy 1∶1比例混合,以4×103/孔的细胞密度接种于96 孔板,加不同浓度的 GCV(0~30 μg/ml),每个浓度设3个复孔,条件培养液2 d更换1次。7 d后MTT法测细胞生存率。
(1)对照组:单独 Daoy细胞;(2)Daoy-tk单独治疗组:Daoy-tk与Daoy细胞按不同比例(1∶1~1∶16)混合;(3)Daoy-tk 与 ATRA 联合治疗组:Daoy-tk与Daoy细胞按不同比例(1∶1~1∶16)混合。以上3组均以4×103/孔的细胞密度接种于96孔板,每种细胞比例设3个复孔,对照组和Daoy-tk单独治疗组加3μg/ml GCV,Daoy-tk与ATRA联合治疗组加3 μg/ml GCV和1μmol/L的ATRA。2 d换液1次,7 d后MTT法测细胞生存率。
实验数据应用SPSS12.0统计,以x±s表示,采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。
不同浓度的ATRA对Daoy细胞作用3 d后,MTT结果表明:在0.5~1μmol/L区间范围内,ATRA即可对Daoy细胞的生长产生明显抑制作用,并且随ATRA浓度的增加,抑制作用逐渐增强。当ATRA浓度为0.5μmol/L时,Daoy细胞的存活率约为90.13%;ATRA浓度为1μmol/L时,Daoy细胞的存活率为79.13%,与ATRA浓度为0μmol/L时的对照组相比存在统计学差异(P<0.05)。见图1。
Daoy细胞与转染后的Daoy-tk细胞分别加入不同浓度的GCV,7 d后MTT结果显示:Daoy-tk细胞在GCV浓度为0.1μg/ml时出现大量死亡,3μg/ml时达到最大杀伤作用,而未转染的Daoy细胞在GCV浓度为30μg/ml时才出现明显死亡,两组差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。
为了观察不同浓度GCV作用下,Daoy-tk细胞通过“旁观者效应”对Daoy细胞的杀伤作用及确定GCV的最低有效剂量,在Daoy与Daoy-tk混合细胞中加入不同浓度的GCV,7 d后MTT结果显示:GCV在3μg/ml浓度时即对Daoy产生最大杀伤作用,此时Daoy细胞的存活率为57.69%。继续加大GCV浓度,不能增强其抗肿瘤效果。见图3。
Daoy-tk与Daoy细胞按不同比例混合,加入3 μg/ml的GCV后,对Daoy细胞产生明显的杀伤作用,并且随Daoy-tk细胞比例的增加,杀伤作用逐渐增强,Daoy-tk∶Daoy=1∶4时,Daoy细胞存活率为89.23%;联合应用1μmol/l的ATRA后,明显增强对Daoy细胞的杀伤作用,Daoy-tk∶Daoy=1∶16时,仍有明显的杀伤作用,Daoy细胞存活率为89.7%。见图4。
自杀基因疗法是基因治疗中研究最广泛、最有希望的治疗方法,在体内外实验中,对多种肿瘤细胞系均具有很强的杀伤作用。但临床实验中抗肿瘤效果并不让人满意[6],除了病毒载体的转染效率低之外,“旁观者效应”作用低下也是重要原因。“旁观者效应”的发挥依赖于细胞间缝隙连接通讯(gap junctional intercellular communicatisn,GJIC)的建立,恶性肿瘤细胞具有浸润性生长、易播散转移的特性,GJIC的建立相对较少[7]。如何增强“旁观者效应”,成为目前自杀基因治疗需要攻克的重要课题。在我们以前的研究中,应用神经干细胞携带TK基因,利用神经干细胞对胶质瘤细胞的主动运动的趋化能力,将TK基因尽可能携带到肿瘤细胞周围,产生更大的“旁观者效应”,获得了非常好的治疗效果[4],但针对“旁观者效应”机制方面加强TK基因抗肿瘤效果的研究报道很少,这方面的工作必将为HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统取得更好的临床疗效提供有益补充。
ATRA是维生素A的重要衍生物,临床已广泛应用于血液系统肿瘤的治疗,其自身即可以诱导肿瘤细胞分化与凋亡。本研究发现ATRA在极低浓度下(0.5~1μmol/L)即可对髓母细胞瘤细胞系Daoy的生长产生明显抑制作用。而有报道ATRA在1~10 μmol/L浓度范围内才可对胶质瘤C6细胞的生长产生抑制作用[8],可见Daoy细胞系对ATRA的敏感性更高。
ATRA除了自身对肿瘤细胞的抑制作用外,还可以上调肿瘤细胞间GJIC的表达。张雪峰等研究表明,ATRA能提高胶质瘤C6细胞系中Cx43的表达,ATRA提高Cx43表达后能进一步增强HSV-tk/GCV系统对胶质瘤的杀伤作用[9]。Chen 等[10]研究表明,联合应用ATRA能增强HSV-tk/GCV系统对前列腺癌细胞的杀伤作用。本实验中我们证实,tk细胞与Daoy细胞比例为1∶4时,对肿瘤细胞生长有明显的抑制作用。联合应用ATRA时即使tk细胞与肿瘤细胞比例低至1∶16时仍有明显的肿瘤抑制作用,并且同等细胞比例条件下,联合治疗组对肿瘤细胞杀伤作用更强。作为脂溶性药物,ATRA可以自由通过血脑屏障在脑内储集,是联合HSV-tk/GCV系统治疗颅内恶性肿瘤的理想用药。
综上所述,ATRA与HSV-tk/GCV系统联合应用,对人的髓母细胞瘤细胞系Daoy的杀伤具有协同作用。联合应用两种临床安全性都已得到证实的治疗方案,必定使颅内恶性肿瘤的治疗具有广阔的前景。
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