高效液相色谱法测定清感利咽颗粒中绿原酸、龙胆苦苷、葛根素的含量

黄宝明 陈汀波 鲍涵 林雪颖 张军 赖小平

清感利咽颗粒由金银花、秦艽、葛根等多味中药组成，具清热解毒，疏散风热，生津止渴之功。用于治疗风热型感冒，药理研究表明其具有确切的抗流感病毒效果。方中金银花为君药，绿原酸是其主要有效成分之一。现代药理研究表明，绿原酸具有显著的抗病原微生物、抗炎、解热、提高免疫功能的作用[1-2]。秦艽、葛根同为臣药，两者的主要活性成分分别包括龙胆苦苷和葛根素。前者具有抗炎、抗病原微生物、中枢兴奋及健胃利胆等药理作用[3]，后者可解热、扩张血管以及促进血液循环等[1,4]。本方的含量测定选用绿原酸、龙胆苦苷和葛根素作为指标成分，采用高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)法同时测定三者的含量。

1 材料

1.1 药品

清感利咽颗粒(批号：20070715、20070716、20070717)，由广州中医药大学新药开发研究中心提供。

1.2 试剂

绿原酸对照品(批号110753-200413)、龙胆苦苷对照品(批号110770-200611)、葛根素对照品(批号110752-200511)，均购自中国药品生物制品检定所；甲醇、乙腈为色谱纯，液相用水为超纯水，其余试剂为分析纯。

1.3 仪器

DIONEX SUMMIT 高效液相色谱仪：四元泵、自动进样器、二级管阵列检测器(DAD)；KQ3200DE型医用数控超声仪(昆山市超声仪有限公司)。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液的制备 分别精密称取对照品绿原酸、龙胆苦苷、葛根素适量，加甲醇溶解定容，制成浓度为绿原酸1.000 mg/ml，龙胆苦苷1.000 mg/ml，葛根素0.508 mg/ml的单一对照品储备液。分别精密吸取绿原酸对照品溶液0.2 ml，龙胆苦苷对照品溶液0.4 ml，葛根素对照品溶液0.2 ml，混合于5 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，制成对照品混合液。

2.1.2 供试品溶液 取装量差异项下的本品适量，研细，取细粉0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中,精密加入60%乙醇25 ml,称定重量,超声处理(250 W，40 kHz)30 分钟, 放冷，再称定重量,用60%乙醇补足减失的重量,摇匀,微孔滤膜滤过, 取续滤液，作为供试品溶液。

2.1.3 阴性对照溶液 按清感利咽颗粒的组成处方及生产工艺，分别制备缺金银花阴性样品，缺秦艽阴性样品和缺葛根阴性样品，照“2.1.2”项方法制得阴性样品溶液。

2.2 色谱条件

色谱柱：Kromasil C18 (4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：甲醇-乙腈(1∶1)混合溶液(A)与0.4%冰醋酸溶液(B)梯度洗脱；梯度洗脱程序：0～30分钟时10%→16% A，30～35 分钟时16% A；流速：1 ml/min；检测波长分别为绿原酸327 nm，龙胆苦苷278 nm，葛根素250 nm；柱温：25℃。绿原酸、龙胆苦苷和葛根素的理论塔板数均不低于10000。在该色谱条件下，绿原酸、龙胆苦苷、葛根素3种成分可达基线分离，其它药材成分对测定无干扰，结果见图1。

A 混合对照品溶液(327 nm)；B 清感利咽颗粒样品(327nm)；C 缺金银花阴性样品(327 nm)；D 混合对照品溶液(278 nm)；E 清感利咽颗粒样品(278 nm)；F 缺秦艽阴性样品(278 nm)；G 混合对照品溶液(250 nm)；H 清感利咽颗粒样品(250 nm)；I 缺葛根阴性样品(250 nm) 1.绿原酸 2.龙胆苦苷 3.葛根素

2.3 线性关系考察

分别精密吸取对照品混合溶液1、2、4、6、8、10、12 μl进行色谱测定，按上述色谱条件测定峰面积，以各对照品进样质量(X，μg)对峰面积(Y，mAu．sec)进行线性回归，求得回归方程分别为：

绿原酸Y=2331.6X-2.4136(r=1)

龙胆苦苷Y=1293.6X-2.0173(r=1)

葛根素Y=3970.7X+0.8616(r=1)

结果表明绿原酸、龙胆苦苷和葛根素分别在0.04～0.48 μg、0.08～0.96 μg、0.02～0.24 μg范围内呈良好的线性关系。

2.4 精密度试验

精密吸取对照品混合液10 μl，连续进样6次，测得峰面积积分值。绿原酸平均峰面积为940.2038，RSD为0.36%；龙胆苦苷平均峰面积为1038.6220，RSD为0.32%；葛根素平均峰面积为810.5972，RSD为0.39%。结果表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液10 μl，分别于0、2、4、8、12 小时进样测定。绿原酸平均峰面积为1062.0976，RSD为1.73% ；龙胆苦苷平均峰面积为874.9224，RSD为1.47%；葛根素平均峰面积为234.0577，RSD为3.40%。表明供试品溶液在12小时内稳定。

2.6 重复性试验

取同一批次样品(20070715)粉末6份，每份约0.25 g，按“2.1.2”项下方法操作。以上述色谱条件测定含量，结果绿原酸平均含量为4.4820 mg/g，RSD为1.57%；龙胆苦苷平均含量为6.5589 mg/g，RSD为1.34%；葛根素平均含量为0.5792 mg/g，RSD为2.27%。结果表明本方法重复性良好。

2.7 加样回收率试验

取同一批次已知含量的清感利咽颗粒(20070715)适量，研细，取细粉约0.125 g，精密称定，分别精密加入绿原酸对照品储备液0.55 ml、龙胆苦苷对照品储备液0.87 ml和葛根素对照品储备液0.15 ml，按“2.1.2”项下方法操作，重复操作6份，按上述色谱条件测定含量，计算回收率，测得绿原酸、龙胆苦苷和葛根素的平均回收率分别为98.67%、97.72%、100.82%；RSD分别为2.57%、1.31%、0.63%。

2.8 样品测定

取装量差异项下的本品适量，研细，取细粉0.25 g，精密称定，按样品制备方法制备供试品溶液，精密吸取10 μl供试品溶液注入液相色谱仪中，测定含量。共测定3批，结果见表1。

3 讨论

供试品溶液制备条件曾考察提取方法(超声、回流)、提取溶剂种类(30%乙醇、60%乙醇、甲醇)、提取溶剂用量(10 ml 、25 ml、50 ml) 、提取时间(15、30、45 分钟)。结果显示样品细粉加25 ml 60%乙醇超声处理30 分钟，即可提取完全，该方法简单、省时。

表1 样品含量测定结果(mg/g)

本实验曾采用乙腈-水、甲醇-水等系统的不同梯度作为流动相，绿原酸的峰形不好。故参考《中国药典》2005版一部中金银花药材的绿原酸含量测定色谱条件[5]，加以改进，采用甲醇-乙腈(1∶1)混合溶液与0.4%磷酸溶液梯度洗脱，分离效果好，重现性强，在各成分的最大吸收波长(绿原酸检测波长为327 nm，龙胆苦苷检测波长为278 nm，葛根素检测波长为250 nm)下可同时测定绿原酸、龙胆苦苷、葛根素的含量，各成分均达到基线分离。由于绿原酸见光易分解，对照品溶液及供试品溶液均应置棕色量瓶，避光操作。

[1]侯家玉. 中药药理学[M].北京:中国中医药出版社，2002,74-75.

[2]吴卫华，康 桢，欧阳冬生，等.，绿原酸的药理学研究进展[J]. 天然产物研究与开发，2006,18(4): 691-694.

[3]杨书彬，王承. 龙胆化学成分和药理作用研究进展[J]. 中医药学报，2005，33(6)：54-56.

[4]潘燕，张岫美. 葛根素药理研究近况[J]. 食品与药品，2005，7(12A)：10-12.