虎杖及其有效成分虎杖苷对肾缺血再灌注损伤的保护作用

李均 李莹莹

肾脏缺血再灌注损伤(renal isehemia reperfusion injury，RIRI)在临床上十分常见，可以由外界创伤、肿瘤压迫、大量失血失液、血管收缩、血栓形成等多种原因引发。肾脏是对缺血缺氧敏感的器官之一，临床上RIRI是导致缺血性急性肾功能衰竭及肾移植失败的主要原因。RIRI的发病机制至今仍未完全阐明，成为国内外学者的研究热点。既往的研究资料表明它与能量代谢障碍、大量活性氧自由基的生成、细胞内钙超载、细胞内的炎症反应、核转录因子-κB、内皮素等多种因素有关。近年来越来越多的中药被国内外学者广泛研究应用于缺血再灌注的防治[1]。本实验选用具有抗氧化作用的虎杖和其主要成分虎杖苷[2]对RIRI进行干预，探讨其对RIRI的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料来源

健康清洁级雄性SD大鼠72只(遵义医学院实验动物中心提供)，体重(200±20)g。虎杖饮片购自遵义医学院第五附属医院中药房，虎杖苷粉购自西安飞达生物技术有限公司，细胞间黏附因子(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)免疫组化SABC法试剂盒、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的酶联免疫吸附测定 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)法试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 动物分组及给药方法

对大鼠进行适应性喂养1周，随机分为4组，假手术组、缺血再灌注组、虎杖预处理及虎杖苷预处理组，每组18只。假手术组和缺血再灌注组大鼠实验前1周给予生理盐水灌胃，虎杖预处理组在实验前1周给予浓度为0.4 g(生药)/ml的虎杖水煎剂2.5 ml灌胃[5 g(生药)/kg体重]，虎杖苷预处理组实验前1周给予浓度为4 mg/ml的虎杖苷细粉悬浊液2.5 ml灌胃(50 mg/kg体重)。于第7天灌胃1小时后开始手术。

1.3 缺血再灌注模型的制备与标本取材

假手术组仅麻醉、开腹、暴露双肾60分钟后缝合伤口。缺血再灌注组、虎杖预处理及虎杖苷预处理组大鼠造模。

根据文献制造缺血再灌注大鼠模型[3]，用3%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉，打开腹腔，游离双侧肾血管，所有大鼠切除右肾，用无损动脉夹夹闭左肾蒂60分钟,同时向腹腔内注射37℃的林格氏液1 ml/100g,后松开动脉夹，若肾脏从紫黑色转为红色说明模型建立成功，若松开动脉夹5分钟后未变成正常红色，说明灌注不成功，应弃去,造模成功后缝合伤口，自由进食、饮水。

各组分别于缺血前10分钟、再灌注6小时、再灌注12小时3个时间点采集肾脏及血清标本，每组每个时间点6只。

1.4 观察指标

免疫组织化学染色SABC法测肾组织ICAM-1，严格按照试剂盒说明书进行检测。

ELISA法检测大鼠血清中TNF-α的含量，严格按照试剂盒说明书进行检测。

2 结果

2.1 各组大鼠肾组织ICAM-1的表达情况

ICAM-1在造模大鼠的肾小管和肾间质上表现为黄褐色颗粒状沉积，各组的ICAM-1有不同程度的表达。ICAM-1在假手术组中几乎无表达。半定量分析显示，术前10分钟时假手术组、缺血再灌注组、虎杖及虎杖苷预处理组大鼠肾组织ICAM-1的表达无明显差别。再灌注6小时、12小时时，缺血再灌注组、虎杖及虎杖苷预处理肾组织中ICAM-1表达明显高于假手术组(P<0.05)。缺血再灌注组各时间点间比较差异有显著性(P<0.05)。再灌注6小时、12小时时虎杖及虎杖苷预处理组肾组织中ICAM-1表达明显低于缺血再灌注组(P<0.05)，虎杖与虎杖苷与处理组无明显差别(P>0.05)。见图1、表1。说明肾脏缺血再灌注后虎杖及虎杖苷均能通过减少肾组织ICAM-1的表达对肾脏起到保护作用。

2.2 各组大鼠血清中TNF-α含量比较

术前10分钟时，假手术组、缺血再灌注组、虎杖及虎杖苷预处理组大鼠血清中TNF-α含量无明显差别。于再灌注6小时、12小时时，缺血再灌注组、虎杖及虎杖苷预处理组血清中TNF-α含量明显高于假手术组(P<0.05)，缺血再灌注组各时间点间比较差异有显著性(P<0.05)。再灌注6小时后虎杖及虎杖苷预处理组血清中TNF-α含量明显低于缺血再灌注组(P<0.05)，再灌注12小时后虎杖及虎杖苷预处理组血清中TNF-α含量与缺血再灌注组无明显差异(P>0.05)，见表2。说明再灌注时间延长，血清中TNF-α含量明显增加，肾组织损伤加重，虎杖及虎杖苷预处理组再灌注6小时时均以减少血清中TNF-α含量而减轻肾脏缺血再灌注损伤作用，于再灌注12小时则均无明显效果。

A 假手术组；B 术前10min组；C 缺血再灌注6h组；D 缺血再灌注12h组；E 虎杖6h组；F 虎杖12h组；G 虎杖苷6h组；H 虎杖苷12h组

组别术前10min6h12h假手术组(n=18)103.43±3.23(n=6)102.56±2.24(n=6)102.34±2.4(n=6)缺血再灌注组(n=18)101.35±4.72(n=6)80.26±3.53ac(n=6)73.23±3.87ace(n=6)虎杖组(n=18)101.56±3.54(n=6)90.11±2.56abc(n=6)86.29±4.75abc(n=6)虎杖苷组(n=18)104.41±1.47(n=6)87.35±5.86abcd(n=6)88.23±6.12abcd(n=6)

注：与假手术组比较,aP<0.05；与缺血再灌注组比较bP<0.05；与术前比较,cP<0.05；与虎杖组比较,dP>0.05；与6小时比较，eP<0.05

表2 各组大鼠血清TNF-α含量的比较

注：与假手术组比较,aP<0.05；与缺血再灌注组比较，bP<0.05; 与术前比较,cP<0.05；与6小时组比较，dP<0.05

3 讨论

ICAM-1即CD54是最早发现的免疫球蛋白超家族黏附分子之一，是细胞表面的糖蛋白，是内皮细胞结构的一部分。ICAM-1通常在正常的肾小球系膜细胞、肾血管、肾小管低表达或无表达。刘百成等[4]研究发现缺血再灌注后早期ICAM-1表达以内皮细胞为主，后期肾脏各部均可表达，肾小管小管上皮尤甚，其表达量与肾功能恶化程度呈正相关，提示ICAM-1在肾缺血再灌注损伤发病机制中起促进作用。TNF -α主要是由单核细胞、内皮细胞和巨噬细胞产生的细胞因子，是炎症反应中重要的参与物，主要通过增强中性粒细胞活性，使活性氧，血小板活化因子等产生增多，引起炎症损伤，同时促进多种炎性细胞因子的释放，引起炎症瀑布式放大效应。在RIRI中，TNF-α表达增加。有实验报道，在RIRI动物模型中应用抗TNF-α抗体可对肾脏结构及功能起到有效的保护作用[5]。

本研究的结果显示：肾缺血再灌注后ICAM-1在各组大鼠的肾小管上皮细胞有不同程度的表达,尤其在模型组，在假手术组中几乎无表达。说明大量的ICAM-1增强了中性粒细胞与血管内皮细胞的黏附，从而促进中性粒细胞的激活、外渗与浸润，加剧肾损伤，且肾损伤随着再灌注时间的延长而加剧。虎杖及虎杖苷组中ICAM-1表达与缺血再灌注组比较明显降低。再灌注6小时后虎杖及虎杖苷预处理组均可减少大鼠血清中TNF-α含量而减轻肾脏缺血再灌注损伤作用，但再灌注12小时后则均无明显效果，其原因可能由于随着再灌注时间的的延长更多的炎性因子释放，这些炎性因子诱导炎性瀑布，放大炎性反应，而导致药物的血药浓度不够，而使其对再灌注12小时后TNF-α含量无明显影响。表明虎杖及虎杖苷均可能在肾缺血再灌注损伤中可通过减少ICAM-1的表达和再灌注后TNF-α含量而起到肾脏保护作用。

[1]李均, 胡绍进. 中药防治肾缺血再灌注损伤的研究进展[J]. 环球中医药, 2009, 2(3): 223-225.

[2]郭胜蓝，孙莉莎，欧阳石，等. 虎杖苷对大鼠急性脑缺血再灌注损伤的保护作用[J].时珍国医国药，2005,16(5):414-416.

[3]Mark L.A.,Robinson A.V.,Schulak J.A..Inhibition of nitric oxide synthase reduces renal ischemia/reperfusion injury[J].Journal of Surgical Research, 2005, 129(2): 236-241.

[4]刘百成，刘耀荣. 大鼠肾缺血再灌注损伤中ICAM-1表达的变化[J]. 中国中西医结合肾病杂志,2006, 7(8): 419-421.

[5]韩述岭，于立新，马俊杰，等. 抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体减轻肾脏缺血再灌注损伤的实验研究[J].第一军医大学学报.2003,23(4): 332-334.