环孢素眼用乳状液的含量测定及稳定性研究Δ

王延东，唐细兰，叶成添，吴 伟（中山大学中山眼科中心，广州市 510060）

干眼症是一种常见的眼表疾病，发病率有逐渐升高的趋势，治疗不当或延误治疗可形成角膜结膜瘢痕，最后角膜结膜失去光泽，角膜混浊导致失明，后果非常严重[1，2]。该症常用的治疗方案是局部应用人工泪液，可改善患者的不适症状，但未能针对病因进行治疗。目前的研究[3]表明炎症和细胞凋亡等因素共同参与了干眼症的发病过程，而环孢素通过减少T淋巴细胞浸润、下调炎症因子及抑制泪腺和结膜上皮细胞的凋亡而成为近几年来干眼症防治领域研究的热点[4，5]。目前国内外采用的环孢素眼局部制剂多存在眼内通透性差、不稳定、刺激性大等缺点而限制了此药的临床应用。据此，笔者研制了低浓度的环孢素眼用乳状液，用于干眼症及其他眼部免疫性疾病的治疗。为探讨贮存条件对环孢素眼用乳状液稳定性的影响，笔者采用高效液相色谱（HPLC）法测定其含量，并用经典恒温加速法对该制剂的室温贮存期进行了预测。

1 仪器与试药

1100 HPLC仪，包括G1314A紫外检测器、G1311A四元泵、G1316A柱温箱、G1322A真空脱气机、G1329A带温控自动进样器（美国Agilent公司）；电子分析天平（德国Sartorius公司）；HH-420恒温水箱（金坛市新一佳仪器厂）。

环孢素标准品（中国药品生物制品检定所，批号：130495-200202，含量：98.8%）；0.05%环孢素眼用乳状液（中山大学中山眼科中心制剂室提供，批号：090212，090218，090309）；乙腈和甲醇均为色谱纯，水为注射用水。

2 方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 色谱条件。色谱柱：Eclipse XDB-C8（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-甲醇-水（67.5∶5∶27.5）；流速：0.8 mL·min－1；检测波长：210 nm；柱温：55 ℃；进样量：20 μL。

2.1.2 溶液的制备。（1）标准品溶液。精密称取环孢素标准品适量，加流动相溶解并稀释制成每1 mL中含环孢素20 μg的标准品溶液。（2）样品溶液。精密吸取0.05%环孢素眼用乳状液2 mL，置于50 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为样品溶液。（3）阴性样品溶液。按处方比例称取除环孢素外的其它基质，按该制剂制备工艺制成眼用乳状液，照“样品溶液”项下方法制成阴性样品溶液。

2.1.3 系统适用性试验。在上述色谱条件下进样，分别记录标准品溶液、样品溶液以及阴性样品溶液HPLC图谱，结果见图1。

由图1可见，环孢素的保留时间约为10.8 min，主药峰与基质峰分离良好，峰形尖而对称，基质不干扰环孢素的测定。

2.1.4 标准曲线的制备。精密称取环孢素标准品25.00 mg，置于50 mL容量瓶中，加少量甲醇溶解后，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为贮备液。精密量取贮备液0.5、1、2、3、4、5、6 mL，置于50 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，制备成质量浓度为5、10、20、30、40、50、60 mg·L－1的系列标准品溶液。取不同质量浓度的环孢素标准品溶液20 μL，滤过，注入色谱仪，在上述色谱条件下记录色谱，测定峰面积。将峰面积（A）与质量浓度（C）作线性回归，得环孢素的线性回归方程为A＝119.6419C－18.4243（r＝0.9999）。结果表明，环孢素检测质量浓度线性范围为5～60 mg·L－1。

图1 高效液相色谱图A.标准品；B.样品；C.阴性样品；1.环孢素Fig 1 HPLC chromatogramA.reference substance；B.sample；C.negative sample；1.ciclosporin

2.1.5 精密度试验。按本品制剂处方，制备低、中、高（10、20、40 mg·L－1）3种浓度模拟内容物，并于同日内的不同时间和不同日分别进样5次，计算日内精密度分别为0.12%、0.06%、0.06%，日间精密度分别为0.36%、0.23%、0.05%。

2.1.6 重复性试验。精密量取同一批号样品6份，照“样品溶液”项下方法制成样品溶液，分别精密吸取20 μL进样测定，记录峰面积，根据回归方程计算含量。结果，环孢素含量的RSD＝0.29%。

2.1.7 稳定性试验。取标准品溶液，分别于0、2、4、6、8、12、24 h测定其峰面积，计算得环孢素含量的RSD＝0.15%。结果表明，标准品溶液在24 h内稳定。

2.1.8 回收率试验。按本品制剂处方，制备低、中、高（10、20、40 mg·L－1）3种浓度模拟内容物，每个浓度制备3份，分别测定其含量，计算回收率，结果见表1。

表1 回收率试验结果（n＝9）Tab 1 Results of recovery test（n＝9）

2.1.9 样品含量测定。按“样品溶液”制备方法制备样品溶液，摇匀，滤过，进样20 μL，分别测定批号为090212、090218、090309的3批样品，结果，标示含量分别为102.91%、98.79%、100.57%，RSD分别为0.40%、0.23%、0.16%。

2.2 经典恒温加速试验[6]

用HPLC法测得0.05%环孢素眼用乳状液的初始标示含量为100.57%，并定为100%。分别取5 mL该制剂分装于消毒安瓿中，封口并置于恒温水浴锅中，分别于95℃、90℃、85℃、75 ℃条件下避光加热，定时（0、24、48、72、96、120、144、168 h）取出并迅速冷却终止反应，取每一时间不同温度下各3个样品进行分析，记录色谱，峰面积积分后取平均值，计算标示含量。与初始标示含量相比，求出其相对百分含量。各温度下不同时间点的环孢素含量结果见表2。

表2 经典恒温加速试验中环孢素相对百分含量变化（%）Tab 2 Relative percentage of ciclosporin in classic isothermal accelerated test（%）

以相对百分含量C的对数lgC对时间t进行线性回归，求出各温度下的反应速度常数（K值），见表3。

表3 各温度下反应速度常数K值结果Tab 3 Results of rate constant of reaction（K）at different temperatures

将各温度下反应常数的对数lgK对绝对温度的倒数1/T进行回归处理，结果，lgK＝－4778.8088/T+10.2710（r＝0.9939），活化能（E）＝－（－4778.8088）×2.303×8.319＝91555.6 J·mol－1＝91.5556KJ·mol－1（E在41.8～125.4 KJ·mol－1时才适用加速试验）。由Arrhenius规律外推可得出25℃、40℃时的K值分别为1.7490×10－6、1.0247×10－5，预测环孢素眼用乳状液在25℃的有效期t0.925℃＝2510.96 d（6.88年）；40℃的有效期t0.940℃＝428.58 d（1.17年）。

2.3 强光照射试验

将制剂在室温（25±2）℃、光照强度（4500±500）Lx的条件下放置10 d，于第5天和第10天取样，按眼用制剂稳定性重点考察项目进行检测。结果，环孢素眼用乳状液的性状、色泽、pH值、含量等各项指标均未见明显变化。

3 讨论

目前环孢素的含量测定虽然多采用HPLC法，但柱温都要求较高，国外文献多采用柱温70～75℃，国内文献则多采用柱温50～65℃，《中国药典》二部[7]中测定环孢素原料也采用柱温70℃。笔者采用上述这些色谱条件测定环孢素眼用乳状液的含量，结果峰形大多较钝，空白基质又对主成分的测定有干扰。考虑到柱温过高会损害色谱柱的寿命，同时也为了更好地提高柱效，本研究建立和改良了环孢素的HPLC检测方法，经回收率和精密度试验证实，采用该色谱条件测定环孢素眼用乳状液的含量，峰形较好，主峰窄而尖，主成分峰与其它峰分离较好，灵敏度高，专一性强，测定结果稳定，回收完全，可以有效控制产品的质量。

考察药物在室温情况下放置至质量指标不合格所经历的时间为留样观察法所测得的药物贮存期。这个方法切合实际，所得贮存期结果准确，但费时太长，尤其对于新药、新制剂的筛选和考察尤为不便；而应用化学动力学中浓度影响反应速度的基本规律及温度影响反应速度的基本规律可以推测出药物的贮存期[6]。根据这一原理，本研究采用经典恒温加速试验来预测环孢素眼用乳状液的有效期。对该制剂的稳定性考察结果显示，该制剂在室温条件下稳定，在25℃贮存的有效期为6.88年，40℃贮存的有效期为1.17年。而且强光照射试验也显示，光照对该制剂的稳定性未见明显影响，所以无需避光保存，在室温下就可保存。

[1]Abelson MB，Walker P，Ousler GW，et al.Dry eye diagnosis：It's all a blur[J].Review of Ophthalmol，2006，13（12）：50.

[2]Barabino S，Dana MR.Dry eye syndromes[J].Chem Immunol Allergy，2007，92：176.

[3]Pflugfelder SC.Anti-inflammatory therapy of dry eye[J].Ocul Surf，2003，1（1）：31.

[4]Wilson SE，Perry HD.Long-term resolution of chronic dry eye symptoms and signs after topical cyclosporine treatment[J].Ophthalmol，2007，114（1）：76.

[5]Perry HD，Donnenfeld ED.Topical 0.05%cyclosporin in the treatment of dry eye[J].Expert Opin Pharmacother，2004，5（10）：2099.

[6]庞贻慧，曾纯素.药物稳定性预测方法[M].北京：人民卫生出版社，1984：35.

[7]国家药典委员会编.中华人民共和国药典（二部）[S].2005年版.北京：化学工业出版社，2005：306.