均匀设计法优化抗晕动中药处方

陈 艳，许景峰，王金萍，曾 明，赵维娟（北京军区总医院药理科，北京市 100700）

晕动病又称运动病，是指机体暴露于被动运动环境中，由于定向功能和平衡功能失调引起的的一系列植物神经功能亢进的应激反应[1]，表现为眩晕、恶心、呕吐等。目前，晕动病的治疗主要通过西药抑制呕吐中枢，这些药物的局限性是具有明显的自主神经系统和中枢神经系统副作用，大多有镇静作用。中药抗晕动病疗效确切，用药安全，因此抗晕动中药的研究具有特殊意义。

Michell[2]认为，大鼠无呕吐反射，在遭受前庭刺激后出现异嗜行为，相当于其它动物的呕吐症状。于旭红等[3]经过大量实验发现并验证了一种抗晕动病药物筛选和评价的新方法——晕反应指数评价法。本研究通过预试验初步筛选出了3味抗晕动中药：生姜、藿香和木香。为了证明其抗晕动效果，并进一步确定达最大抗晕动药效三者间的最佳配比，笔者采用均匀设计安排各试验点，以小鼠旋转刺激诱发晕动病，以晕反应指数为评价指标进行处方优化。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1050 series高效液相色谱（HPLC）仪，包括Agilent 1050四元泵、G79853A紫外检测器、Agilent 1050色谱工作站（美国惠普公司）；纯水系统（美国HiTech公司）；JA2003 M型电子天平（上海天平仪器厂）；WTD500A型可控性三臂式旋转仪、塑料挂篮（高30 cm、直径15 cm）由第二军医大学药理教研室自制。

1.2 试药

生姜（山东安丘白芬子镇）、广藿香（江西吉水县水南药用百草油提炼厂）、木香（本院中药房领取）经笔者薄层及气相鉴别为真品；6-姜酚标准品（天津中新药业集团股份有限公司，批号：6-JF-070711，经1H-NMR、13C-NMR、IR、UV、MS鉴定为6-姜酚，经HPLC法检查纯度＞98%）；木香烃内酯（CT）、去氢木香内酯（DL）对照品（中国药品生物制品检定所，批号分别为111524-200503、111525-200706）；茶苯海明（北京益民药业有限公司，批号：080512）；吐温-80（国药集团化学试剂有限公司）。

1.3 动物

清洁级昆明种小鼠，♀♂各半，体质量（18～22）g，由第二军医大学实验动物中心提供（实验动物质量合格证号：SCXK（沪）2007-0003）。小鼠随机分为处方1组、处方2组、处方3组、处方4组、处方5组、茶苯海明组和空白对照组，每组10只，♀♂各半。

2 方法与结果

2.1 药材的提取与检测

2.1.1 姜油的萃取：取生姜鲜品，切片，自然晾干，按2005年版《中国药典》[4]精密称取适量进行超临界CO2（SFE-CO2）萃取得姜油。优化后的萃取工艺为：萃取温度45℃，萃取压力30 MPa，二级高压萃取釜萃取浸泡时间2.5 h，流体取样量约5 mL，取样过程气体流速0.3～0.9 L·min-1。用HPLC法测得提取物中6-姜酚的含量为19.023%，表明提取物质量较好。

2.1.2 广藿香挥发油的提取：以茎叶比2∶8取广藿香药材，粉碎，过2号筛（24目），混合均匀，精密称取药材碎末，置挥发油提取器的2000 mL硬质圆底烧瓶中，加水800 mL，加入几粒沸石，充分振摇混匀后加塞密闭浸泡2 h，接通冷凝水，缓缓加热烧瓶至微沸并保持微沸，调节冷凝水的大小使馏出液的温度低于40℃，直至挥发油的体积不再增加，停止加热，收集油层部分。照2005年版《中国药典》的气相色谱法[6]对提取物进行含量测定。本品含百秋李醇为26.12%，符合规定。

2.1.3 木香的提取：将木香药材粉碎，精密称取适量，按正交试验优化的最佳工艺进行回流提取：10倍量80%乙醇，回流提取3次，每次1 h。本研究采用水浴回流，温度控制在84℃左右。用纱布粗滤后再用滤纸过滤，收集样品提取液于旋转蒸发仪上减压回收乙醇，并将提取液进行浓缩。采用HPLC法进行测定[5]，每1 g木香药材提取木香烃内酯13.485 mg、去氢木香内酯16.252 mg。

2.2 均匀设计方法

2.2.1 因素水平：大量文献的调查及预试验结果初步确定3个考察因素及其水平的基本范围为：生姜0～80 g，藿香0～60 g，木香0～10 g，水平数≥5。因素水平见表1。

表1 因素水平Tab 1 Factors and levels

2.2.2 均匀设计试验结果：由于因素为3，m/2+1＝3，m＝4（m为最多可安排的列数），n＝m+1＝5（n为行数），故选取均匀分布表U5（54）。由于本研究只有3因素，则从相应的使用表中查得因素为3时对应的列号是1、2、4列，因此组成5行3列的U5（53）表，其中1～5组为试验组，第6组为使用茶苯海明作对照药的阳性对照组，第7组为空白对照组。均匀设计试验结果见表2。

表2 均匀设计试验结果Tab 2 Results of optimizing experiment

2.3 药效学实验

2.3.1 刺激量的设定：旋转器为可控性三臂式旋转仪，三臂的臂长均为28 cm，每臂挂3只挂篮，每只挂篮放动物1只。实验时小鼠无束缚地放入旋转器塑料挂篮内，绕垂直轴水平旋转。处方1～5组及茶海拉明组、空白对照组给予的刺激量均为：以80次·min-1顺时针方向旋转1 min，然后逆时针方向旋转1 min，如此反复持续刺激动物90 min致晕。

2.3.2 给药量：分别以表2中实验1～5组中各药材的量，按每20 g小鼠体质量给予剂量的0.0026倍量进行ig给药，生姜、藿香和木香的剂量分别按提取率折算成提取产物（以2%吐温-80溶液配制，每20 g小鼠体质量的给药体积为0.3 mL）；茶苯海明组：每20 g小鼠体质量给予0.13 mg茶苯海明（以2%吐温-80溶液溶解药物，每20 g小鼠体质量的给药体积为0.3 mL）；空白对照组：ig等量2%吐温-80溶液。

2.3.3 评价指标：♀♂小鼠分别饲养在代谢笼内，可自由饮水和进食，适应性饲养3 d，每次于实验开始的前一天晚上12∶00左右给小鼠禁食，可自由饮水，第二天早上8∶00左右开始实验。取同性别小鼠各组1只分别按上述剂量进行ig给药，给药后30 min以上述旋转刺激方式和时间进行旋转刺激，刺激结束后将动物置于地面，立即观察动物的反应。所有的反应均在旋转结束后2 min内产生，计算出晕反应指数。评分标准见表3。

表3 评分标准Tab 3 Scoring criteria

2.3.4 结果：受刺激前小鼠皮毛光滑，反应灵敏。随着刺激时间的延长，小鼠全身毛皮耸立蓬松，排便、尿次数明显增多，活动明显减少，部分小鼠出现颤抖、烦躁不安、多动、咀嚼等现象。刺激停止后60 min逐渐恢复。

由于实验5 d每天的天气晴阴、环境因素不同均会影响小鼠的晕反应强度，为使数据具有可比性，1～5 d必须分天统计，每天以茶苯海明组的两轮晕反应指数之和为100%，其它各组的两轮晕反应指数之和除以当天茶苯海明组两轮晕反应指数之和作为晕动率，以5 d晕动率之和为统计量，旨在减少实验误差。晕反应指数测定结果见表4。

3 讨论

表4 晕反应指数测定结果Tab 4 Results of MS index

由于随时间的推移动物的饥饿状态和环境等发生变化，禁食至下午的小鼠晕反应不明显，因此实验分5个上午进行，每个上午进行两轮，每轮分别取1～7组每组1只同性别小鼠进行实验。

利用Uniform Design Version 2.20均匀设计软件采用全回归法对表4中数据进行多元回归分析，得多元线性回归模型无效，即线性不显著。根据均匀设计的理论，可以利用均匀设计的试验点布点均匀、代表性强的特性，用直接观察法从所有试验中挑选表现最好的试验条件组合而结束试验设计（不再进行数据的分析处理）。从表4中可以看出，处方1、2组的晕反应指数显著低于茶苯海明组，说明处方1、2组的抗晕效果显著强于茶苯海明药，其中处方2组的晕反应指数最低，抗晕效果最好；处方3、5组的晕反应指数与茶苯海明组较接近，其中处方3的抗晕作用略强于茶苯海明，处方5略弱于茶苯海明；处方4组的晕反应指数显著高于茶苯海明组，抗晕效果较差。

采用SPSS统计软件对表4中各组晕动率进行统计处理，2组间比较采用非配对t检验，多组间比较采用ANOVA方差分析。结果表明，处方1、2显著优于茶苯海明，处方4显著弱于茶苯海明。因此，选定处方2（生姜60 g，藿香45 g，木香5 g）为最佳处方。

[1]王尔贵，薛龙增，张炳新，等.晕动病的病因及防治[J].听力学及言语疾病杂志，2002，10（4）：276.

[2]Michell D.Motion Sickness-induced pica in rats[J].Clin Nutr，1977，30：147.

[3]于旭红，苏定冯.抗运动病新药的研究：从新的动物模型到新的模型动物[D].第二军医大学硕士论文，2007.

[4]国家药典委员会编.中华人民共和国药典（一部）[S].2005年版.北京：化学工业出版社，2005：30、66.

[5]童荣生，孙世明，吴正中.反相高效液相色谱法测定理气复胃口服液中木香烃内酯的含量[J].中国药房，2006，17（3）：211.