糖尿病足神经及动脉组织中α-肌动蛋白表达与中医辨证分型的相关性研究

糖尿病足是指糖尿病患者由于合并神经病变和各种不同程度末梢血管病变而导致下肢感染、溃疡和(或)深部组织破坏，属于糖尿病常见严重慢性并发症，也是糖尿病患者致残主要原因之一。通过对糖尿病足截肢标本的分子生物学研究，进一步探讨糖尿病足的发病机制，论述其与中医辨证分型的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料

100例糖尿病足截肢标本均来自天津中医药大学第一附属医院2005年8月至2007年7月住院患者。截肢患者中男61例，女39例，年龄54～88岁，平均68.3岁。截肢患者糖尿病病程最短8年, 最长31年, 平均(18±3.7)年。

1.1.1 诊断标准 糖尿病足的诊断标准采用2000年中华医学会糖尿病学分会第2届糖尿病足会议所制定的 “糖尿病足(肢端坏疽)检查方法及诊断标准”。

1.1.2 截肢标准 参照国际糖尿病足工作组编写的《糖尿病足国际共识》中关于“大截肢的定义、标准和指标”执行。

1.1.3 排除标准 有严重的手术禁忌证、动脉硬化闭塞症、急性动脉栓塞、雷诺病等其它肢体缺血性疾病。

1.1.4 中医辨证分型标准 参照《中医外科学(第7版)》及《中药新药临床研究指导原则·脱疽》之中医辨证分型方案分为气血两虚瘀阻、气阴两虚瘀阻、脉络热毒型3种证型。

1.2 方法

1.2.1 标本的留取 采取多层面留取，即按小腿上部、内踝、足背3个部位分别留取。标本经过10%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，备用。

1.2.2 设备与试剂 α-肌动蛋白(α-actin)鼠抗人单克隆抗体(天津市津脉基因测绘技术有限公司提供)；SP-9000免疫组化染色试剂盒；ZLI-9031浓缩型DAB试剂盒(均由北京中杉金桥生物技术有限公司提供)。

1.2.3 免疫组织化学法 标本常规石蜡包埋, 4μm连续切片,采用SP法进行免疫组化染色,染色过程严格按试剂盒染色程序进行，选取已知的阳性切片作阳性对照，磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。其中一抗浓度为1∶200。

1.2.4 图像分析 采用图像分析软件(Image-Pro Plus Analysis software)测量，在400倍光镜下，每张切片随机取4个视野，测量平均光密度(MOD)，即400倍单位视野面积的平均光密度，其值与蛋白表达呈正比。

1.2.5 统计学方法 数据以表示，应用SPSS 11.5统计软件进行分析，采用方差分析。P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

α-actin在糖尿病足的不同辨证分型的神经组织以及动脉组织中表达均呈阳性，见图1、图2(彩图见封3)。并且阳性的表达与证型之间有高度的相关性。在神经组织以及动脉组织中均是脉络热毒证表达最强，气血两虚瘀阻证表达最弱。在神经组织中：三证型间比较有显著性差异，三证型中各部位比较均无显著性差异。在动脉组织中：脉络热毒证与气阴两虚瘀阻证、气阴两虚瘀阻证与气血两虚瘀阻证、气血两虚瘀阻证与脉络热毒证比较均差异显著。三证型内部各部位比较除脉络热毒证中腓肠肌中点与足底部动脉比较差异有显著性，其余差异均无显著性。见表1～4。

图1 ×400 α-actin在动脉中的阳性表达

图2 ×400 α-actin在神经中的阳性表达

中医证型nMOD脉络热毒320.107±0.015气阴两虚瘀阻330.089±0.005气血两虚瘀阻350.081±0.017

注：三证型间比较，χ2=33.04，差异有显著性(P<0.05)。

表2 各证型不同部位神经组织中α-actin的表达

表3 各证型动脉中α-actin的表达

注：与脉络热毒比较，aP<0.05；与气阴两虚瘀阻比较，bP<0.05。

表4 各证型不同部位动脉中α-actin的表达

注：脉络热毒中腓肠肌中点与足底比较,aP<0.05。

3 讨论

糖尿病肢端坏疽是一种慢性、进行性，涉及大、中、小及微血管的疾患，主要是代谢紊乱、肢端缺血、神经病变、感染等多种诱因所致。糖尿病足的病变组织首先涉及血管及神经，血管及神经的病变不断发展，进而引起肌肉的病变，糖尿病足的损伤首先表现在神经、血管及肌肉等组织上，进而影响器官乃至整个系统，因此我们从血管、神经这些组织入手，利用分子生物学研究这些组织微观上的变化，进而研究糖尿病足的发病机制，探讨其与中医辨证分型的联系及相关性。

肌动蛋白纤维参与构成微丝与细肌丝，是肌细胞和非肌细胞的运动成分[1]。血管内皮细胞的骨架有三种结构：微丝、微管和中间丝，以微丝在维持内皮细胞形态和完整性中所起作用最重要。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)在成年个体是一种高度特化的细胞，具有收缩、调节血管张力和维持血压等功能。α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle-actin，α-SM-actin)是细胞来源于平滑肌组织的标志，在不同表型的平滑肌细胞中具有不同的表达比例。根据其表达比例的不同，主要被分为两种表型：收缩型、增殖型。成熟的VSMC处于较低的增殖速率，以收缩表型为主；在刺激因素如血清血小板衍化生长因子(Platelet-derived growth factor，PDGF)等血浆反应因子(Serum response factor，SRF)作用下或血管内膜损伤，VSMC表型发生改变，以合成表型为主，促使VSMC增殖、迁移，并产生多种胞外基质如胶原、弹力蛋白、蛋白聚糖等，在动脉粥样硬化的形成和发展中起重要作用。α-SM-actin是平滑肌细胞分化成熟的最主要的细胞骨架蛋白，许多研究认为α-SM-actin是表现VSMC收缩表型的重要标记物。细胞内α-SM-actin含量的改变与细胞表型转变是一致的，其表达减少标志着细胞由收缩型向合成型转化[2-3]。本试验也证实了随着病情的不断加重，VSMC由收缩性转变为合成型，促使VSMC增殖，迁移，使中膜平滑肌细胞增殖明显，以致管腔狭窄。加重缺血，使局部营养障碍，症状加重。

在神经元发育过程中，神经突起沿特定的路线生长、延长，并伸向将与它建立突触联系的靶细胞、神经元的胞体、树突或轴突。而在神经突起伸长及向特定的方向生长方面，生长锥(growth cone)起决定作用。生长锥是个活跃运动的结构，其与神经突起的生长、轴突的特殊途径的选择、靶细胞的识别和突触的形成有关。神经突起的生长、伸长只发生在生长锥。肌动蛋白在生长锥的可动性中可能起关键作用[4-5]。生长锥的板足及丝足的活跃运动有赖于肌动蛋白有序、快速的聚合和解聚。在神经系统发育过程中，正是由于细胞骨架的参与，轴突才能循着正确的路径长至相应的靶细胞。糖尿病足的发展过程中，随着病变的发展，血管结构和功能逐渐破坏，进而影响到神经，肌动蛋白生成减少，生长椎的可动性降低，抑制了神经突起的生长，从而引起一系列的神经症状，随着病程的不断增长，病情的不断加重，神经方面的症状也随之越来越严重。

由实验结果可以看出证型不同，细胞损伤也相应的有差别，特别在气阴两虚瘀阻证和脉络热毒证中表现尤为突出。气血两虚瘀阻证表达最低说明细胞受损严重，所以临床中治疗糖尿病足常用益气养阴、清热利湿、活血化瘀药物以减轻症状，此研究结果为此法的广泛应用提供了客观的实验依据，对临床具有重要的指导意义。通过本实验，证实了糖尿病足的中医辨证分型与病理学之间有相关性，同时也表明了α-actin在糖尿病足的动脉、神经中的作用和损伤机理及其与病情的关系，对这一问题的深入研究，可能为临床防治糖尿病足提供新的思路，研究出作用于血管、神经中肌动蛋白的药物，从而抑制血管、神经病变的发展，达到预防和控制糖尿病足的疗效。

[1] Gardel ML, Nakamura F, Hartwig JH, et al.Prestressed F-actin networks cross-linked by hinged filamins replicate mechanical properties of cells[J].PNAS, 2006, 103 (6): 1762-1767.

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[3]Marina A, Glukhova, Alexander E, et al.Modulation of human aorta smooth muscle call phenotype: a study of muscle-specific variants of vinculin,caldamon,and actin expession[J].Proc Natl Acad Sic USA, 1998, (85): 9542-9546.

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