通脉大生片对排卵障碍型不孕大鼠FSH、LH、TGF-β1的影响研究

通脉大生片是成都中医药大学第一附属医院用于妇科临床50余年的院内制剂，来源于著名中医学家卓雨农老先生自制方“通脉大生丸”，在肾虚、冲任虚损所致的排卵障碍、黄体功能不健的不孕症等方面取得较好的临床疗效。本实验主要研究通脉大生片对排卵障碍型不孕大鼠血清的FSH、LH及TGF-β1含量的影响，进一步明确其治疗肾虚、冲任虚损所致的排卵障碍、黄体功能不健的不孕症作用机理。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康9日龄SD系雌性大鼠，出生后母鼠哺乳至22 日龄断奶，专人饲养。利用自然光照，室温维持在20～25 ℃，动物和饲料均由成都中医药大学实验动物中心提供，SD大鼠批号为：SCXK(川)2008-11。

1.1.2 试剂及仪器 丙酸睾丸酮注射液，规格：25 mg∶1 ml，天津金耀氨基酸有限公司生产，批号：0707031；通脉大生片，规格：0.3 g/粒，成都中医药大学院内制剂，批号：090324；枸橼酸氯米芬片，规格：50 mg/片，批号：A1102，Codal Synto Limited,Cyprus/赛普路斯企业生产；大鼠促卵泡素(FSH)酶联免疫分析试剂盒，批号：DEZ30597，由RD公司提供；大鼠促黄体生成素(LH)酶联免疫分析试剂盒，批号：DEZ30623，由RD公司提供；大鼠转化生长因子β1(TGF-β1)酶联免疫分析试剂盒，批号：DEZ30636，由RD公司提供。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备及分组 应用SPSS13.0统计软件包产生的随机数字表，将66只9日龄SD雌性大鼠随机分为空白对照组，模型组，通脉大生片高剂量组，通脉大生片中剂量组，通脉大生片低剂量组，氯米芬片对照组，共6组。参照俞瑾等[1]研究方法，于实验组和模型组颈背部皮下注射丙酸睾丸酮1.25 mg/只(0.05 ml/只)。正常组在同等条件下饲养，未作特殊处理。第22日龄断奶，利用自然光照，室温维持在20℃左右，并由专人在同样条件饲养。第70日龄(大鼠体重约150 g左右) 阴道开口。连续阴道涂片2个性周期(1个性周期为5天)，观察其阴道上皮细胞有无性周期变化，阴道上皮无性周期变化，则提示无排卵大鼠模型制作成功。

1.2.2 给药方法 从第80天开始，各组分别按如下方法给药，按临床用药，以60 kg 人为标准，按照体重—剂量换算法计算大鼠给药剂量，低剂量、中剂量、高剂量一次为人的5倍、10倍、20倍换算。模型组和正常组给1 ml (100g·d)生理盐水灌胃；通脉大生片高剂量组给予0.12 g /ml(100g·d) 灌胃；通脉大生片中剂量组给予0.06 g /ml(100g·d) 灌胃；通脉大生片低剂量组给予0.03 g/ml(100g·d) 灌胃；氯米芬片组给予0.83 mg/ml(100g·d) 灌胃，每天灌胃1 次，连续灌胃5周后股动脉取血处死大鼠。

1.2.3 检测方法 阴道脱落细胞检查：大鼠第70日龄，每日清晨将蘸有生理盐水的无菌棉签轻轻插入大鼠阴道内，并缓慢转动，慢慢的将棉签抽出，将棉签上的粘液均匀的涂布于载玻片上，待涂片自然晾干后，用95%乙醇固定l5～30分钟后取出，采用巴氏染色法，在显微镜下观察并判定其性周期，连续两个性周期，以判定造模的成功与否；连续灌胃5周后，股动脉取血并处死大鼠，取出的血在室温下静置两小时后，用转速3000转/分离心10分钟取上清液，用酶联免疫法检测血清中FSH、LH和TGFβ-1的浓度，取出卵巢组织，小心的剔除脂肪组织，用10%甲醛固定，包埋、切片、HE染色，在100倍光镜下观察其病理形态学变化。

2 结果

2.1 对卵巢的病理形态学观察结果

镜下模型组卵巢苍白，表面见大量的病理性囊性卵泡，较多闭锁卵泡和原始卵泡存在，无成熟卵泡，卵泡较小，卵泡内含大量浆液性物质，卵泡壁颗粒细胞排列稀疏，层次明显减少，间质过度增生，无黄体生成；给药组大鼠卵巢色泽较模型组鲜红，卵泡较模型组增大，病理性囊性卵泡减少，卵泡壁颗粒细胞排列较密，层次增加，有成熟卵泡，有少量黄体生成；正常组大鼠卵巢色泽红润，卵泡发育良好，成熟卵泡较多，表面见较多黄体。

2.2 各组间FSH、LH水平比较

各组间FSH水平比较见表1。模型组与正常组比较P<0.01，差异有显著性。通脉大生片高剂量组FSH水平高于模型组，P<0.05，差异有显著性。模型组与通脉大生片中、低剂量组比较均P>0.05，差异无显著性。模型组与氯米芬片组比较，P<0.05，差异有显著性。通脉大生片高剂量组FSH水平高于中、低剂量组，P<0.05，差异有显著性。通脉大生片高剂量组与氯米芬片组比较P>0.05，无显著差异。

各组间LH水平比较见表1。模型组与正常组比较P<0.01，差异有显著性。模型组与氯米芬片组比较，P<0.01，差异有显著性。通脉大生片高、中、低剂量组LH水平均高于模型组，P<0.01，差异有显著性。通脉大生片各组与氯米芬组比较，均P>0.05，无显著差异。通脉大生片高剂量组与正常组比较P<0.01，差异有显著性。

表1 各组间FSH、LH水平统计结果比较

2.3 各组间TGF-β1水平比较

各组间TGF-β1水平比较见表2。模型组与正常组比较P<0.01。通脉大生片高剂量组TGF-β1水平高于模型组，P<0.01，差异有显著性。

表2 各组间TGF-β1水平统计结果比较

3 讨论

现代研究发现卵巢排卵既受下丘脑—垂体—卵巢轴的调控，也受卵巢局部微环境特别是非固醇网络的调控，即卵巢的自分泌—旁分泌系统在卵巢局部发挥微调节作用。中医药在肾主生殖理论指导下，用补肾为主的中药治疗不孕症在临床上具有特殊的优势。已有相关研究补肾中药能够调节性腺轴而促进卵泡的生长发育，但对卵巢局部调控研究机制尚不明确。

3.1 对FSH、LH的影响

FSH是一种糖蛋白激素，是卵泡发育的启动因子[2]。若无FSH则卵泡发育不能超过窦周生长阶段，卵泡不发育，E2水平低，生殖器官的生长和促性腺激素的分泌负反馈受影响[2-3]。本研究发现，FSH水平，模型组与正常组比较，P<0.01，表明造模后大鼠血清内FSH浓度明显降低。模型组与氯米芬片组比较，P<0.05，FSH显著升高。通脉大生片高剂量组与模型组比较，P<0.05，差异显著，表明通脉大生片可以升高大鼠血清内FSH水平，卵巢病理形态学表明经通脉大生片治疗后颗粒细胞增多，层次增加。由此可见，通脉大生片治疗排卵障碍，其促排卵的作用机制之一为促使FSH水平的分泌，通脉大生片高剂量组升高FSH的作用与促排卵公认的氯米芬片阳性对照药物极为相似，并不亚于氯米芬片(P>0.05)。

LH的主要生理功能是刺激卵泡膜细胞17α羟化酶活性,由胆固醇和孕烯醇酮合成的雄激素在颗粒细胞中扩散,通过芳香化酶激活转变成雌激素。LH可协同卵泡发育晚期的FSH起作用，还可刺激优势卵泡颗粒细胞上的孕激素受体的表达[2]。在本研究中，正常组与模型组比较差异均显著，P<0.05,表明通过注射睾酮后，模型组LH水平明显下降，但是经过治疗后，各给药组LH水平与模型组比较，均明显上升(P<0.01)，差异显著，有统计学意义。与FSH恰恰相反，通脉大生片对于模型大鼠血清内LH水平来说，中低剂量更能明显的升高LH水平，尤以低剂量组更显著，其值接近正常值水平(P>0.05)，且与阳性对照药物氯米芬片之间差异无统计学意义。而高剂量组虽然与模型组有差异(P<0.01)，但是却与正常组之间的差异有统计学意义(P<0.01)，说明通脉大生片高剂量组虽然能升高LH，但尚未达到正常范围。由此可见，通脉大生片低剂量组在升高LH方面优于其他治疗组。

3.2 对TGF-β1的影响

TGF-β是一类具有多种生物活性的细胞因子，TGF-β1 促进卵泡生长和分化[4]。TGF-β1 可提高颗粒细胞对低剂量FSH 刺激的敏感性[5]，而FSH 是卵泡发育成熟的主要启动因子[10]，卵巢局部TGF-β1 适当的表达, 促进卵泡发育、黄体的形成，而其水平异常也会导致卵泡发育异常和排卵障碍[4-6]。

本研究发现，模型组血清中TGF-β1与正常组比较明显下降，差异显著(P<0.01)，表明造模后血清中TGF-β1降低，经过治疗后，各组TGF-β1均比模型组升高(P<0.05)，通脉大生片高、中剂量组升高TGF-β1接近正常值水平(P>0.05)，且中高剂量与氯米芬片组升高TGF-β1的程度相当。有研究发现外源性因素刺激促使卵泡产生TGF-β1增强，引起卵巢间质纤维化的发生[7]。TGF-β1在卵巢局部是通过其受体发挥生物学作用，本研究结果提示大鼠血清低TGF-β1水平与卵巢局部TGF-β1受体高表达有可能是导致排卵障碍的途径之一，这将需要进一步研究方能明确。

中医学理论认为肾藏精，主生长发育，为生殖之本，内寓真阴真阳，肾气盛，天癸至，冲任通盛，则月经如期，孕育正常，即肾-天癸-冲任-胞宫轴在女性生殖系统中起着主导作用。卵子属“生殖之精”的范畴，先天生殖之精藏于肾，肾精滋长是卵子发育成熟的基础，充盛的肾精是实现排卵的物质基础，肾精亏虚，卵子缺乏物质基础而不能成熟。而卵子的正常排出有赖于肾阳鼓动，“肾者主蛰，司开合”，阳主乎动，肾阳作为内在动力鼓动成熟卵子排出。冲为血海，任主胞胎，经云：“任脉通, 太冲脉盛, 月事以时下, 故有子”，冲任流通, 气血畅达, 卵子才能顺利排出。其中任何一个环节出现问题，均会导致排卵功能障碍而致不孕。这与现代医学下丘脑—垂体—卵巢轴极为相似。辛明蔚[8]同样认为目前，卵泡发育不良性不孕症病因病机比较明确，即以肾虚为主，又与肝郁、脾虚、冲任气血失调密切相关，治疗总以补肾为主，辅以疏肝、健脾、养血活血调冲任。

通脉大生片是由杜仲、续断、桑寄生、肉苁蓉、紫河车、茯苓、山药、枸杞、首乌、台乌、当归、荔枝核、车前仁等十七味中药组成，方中用紫河车、肉苁蓉、杜仲、续断温补肾阳，血肉有情之品直入下焦，填奇经之精，补奇经之气；配以枸杞子、首乌、当归养肝阴，补益奇经之血；辅以山药、茯苓、车前仁、桑寄生健脾利湿，调理脾胃，当归、台乌、荔枝核活血行气，通其脉络，共凑通补之效。全方具有温肾填冲，调补气血，通畅脉络的作用。本研究发现通脉大生片可以升高大鼠血清FSH，LH，其升高FSH作用尤以高剂量组明显，升高LH以通脉大生片低剂量组更为明显。由于FSH，LH由脑内垂体分泌，故可认为通脉大生片可以提高垂体的内分泌功能；同样，通脉大生片可以升高大鼠血清内TGF-β1水平，以高剂量组较为明显，其导致该效应的机理，尚需进一步探讨。

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