结核分枝杆菌重组双歧杆菌-ESAT-6-MPT64疫苗的构建及鉴定

曾莉蓉，李文桂

1.恩施州中心医院消化内科(湖北 恩施 445000)

据世界卫生组织估计，全世界近1/3的人感染过结核分枝杆菌(Mycobacteria tuberculosis，MTB)，而且每年约有900万新发临床病例及300多万死亡病例，我国每年新发耐多药结核12万例[1]。结核病已成为严重的公共卫生和社会问题。卡介苗(BCG)这一传统疫苗的免疫保护效果不稳定(0～80%)[2]。因此，研制安全有效的新型疫苗是控制结核病的重要途径。ESAT-6和MPT64均为结核杆菌的早期分泌性蛋白，实验证实二者可诱导特异性细胞免疫并刺激IFN-γ的产生[3]。研究提示，ESAT-6和MPT64均具有较强的细胞免疫活性，而在大多数BCG中又缺乏其编码基因，因此二者有望成为基因疫苗的候选目的基因。Missich等通过实验构建以双歧杆菌为载体的重组质粒，为研究双歧杆菌疫苗奠定了基础。因此，本研究构建融合基因重组质粒pGEX-ESAT-6-MPT64，通过电转化至双歧杆菌，构建重组Bb-ESAT-6-MPT64疫苗，为预防结核病提供一种新型有价值的疫苗。

1 材料与方法

1.1材料MRS培养基、LB培养基、大肠埃希菌BL21由本实验室保存； pGEX-1λ和双歧杆菌分别由华西医科大学微生物学教研室和武汉大学菌种保存中心赠送；基因组提取试剂盒、质粒抽提试剂盒和胶回收试剂盒等由上海生工公司提供；工具酶T4DNA连接酶、BamHI和EcoRI由Fermentas公司提供；结核分枝杆菌H37Rv标准株由重庆市肺科医院提供。

1.2方法

1.2.1 引物设计 分别设计4条引物：P1：5’-CGGGATCCATGACAGAGCAGCAGTG-3’；P2:5’-GCTGCCGCCACCGCCGCTTCCGCCACCGCCGCTTCCACCGCCACCTGCGAACATCCCAGTGA-3’；P3：5’-GGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTGGCGGCAGCGTGCGCATCAAGATC-3’；P4：5’-TCTGAATTCGCCAAACTTGCCGAACAAGC-3’；其中P1为ESAT-6上游引物，5’端引入BamHI位点，P2为其下游引物；P3为MPT64上游引物，P4为其下游引物，P4的5’端引入EcoRI位点；P2、P3斜体部分为Linker(互补碱基对的疏水甘氨酸接头)，4条引物由上海生工公司合成。

1.2.2 ESAT-6-MPT64融合基因的扩增及鉴定 首先以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板，P1和P2为引物，PCR扩增ESAT-6-Linker(扩增条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，58℃退火60 s，72℃延伸60 s，共28个循环，最后72℃延伸5 min)，以P3和P4为引物，同上述条件扩增Linker- MPT64，然后以二者的PCR纯化产物为模板，P1和P4为引物，扩增ESAT-6-MPT64融合基因片段(扩增条件：95℃预变性4 min， 62℃退火50 s，余条件相同)，融合基因PCR产物采用上海生工公司的胶回收试剂盒纯化， 1.2%琼脂糖凝胶电泳对纯化产物进行鉴定，送上海生工公司进行测序。

1.3大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭质粒pGEX-1λT的制备将质粒pGEX-1λT转化至已制备好的BL21感受态细菌，接种至含有50μg/ml氨苄青霉素抗性的LB固体培养基上进行增菌和筛选，用质粒抽提试剂盒小剂量抽提。

1.4 重组质粒pGEX-ESAT-6-MPT64的构建

1.4.1 目的基因及载体大片段的制备 二者PCR产物均进行BamHI及EcoRI双酶切， 酶切产物由1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.4.2 连接 取载体2μl与目的基因8 μl置于10 μl连接体系，16℃过夜后，置70℃15 min，灭活T4DNA连接酶。连接产物接种至含有50 μg/ml氨苄青霉素抗性的LB固体培养基上进行增菌和筛选，质粒抽提试剂盒抽提重组质粒pGEX-ESAT-6-MPT64。

1.5重组质粒pGEX-ESAT-6-MPT64的酶切鉴定

pGEX-ESAT-6-MPT64进行BamHI及EcoRI双酶切，酶切产物由1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，重组质粒中的目的基因送上海生工公司测序。

1.6重组Bb-ESAT-6-MPT64的鉴定将Bb菌种接种于100 ml含0.5 mol/L蔗糖的MRS液体培养基中，37℃厌氧培养48 h，冰浴3 h；多次离心弃上清后取80 μl Bb和20 μl重组质粒pGEX-ESAT-6-MPT64于同一体系进行电穿孔(电穿孔参数：电压1.2 kV、转化时间5 ms、转化次数2次)，转化完毕后用含50 μg/ml氨苄青霉素的MRS琼脂平板对rBb阳性重组子进行增菌和筛选，质粒抽提试剂盒提取重组质粒，以抽提的质粒为模板，P1和P4为引物进行PCR扩增(扩增条件同融合基因)，1.2%琼脂糖凝胶电泳对PCR纯化产物后进行鉴定，送上海生工公司进行测序。

2 结果

2.1 PCR扩增pGEX-ESAT-6-MPT64融合基因图1可见：扩增的目的条带约1000 bp左右。送上海生工公司测序其长度为1020 bp，与预期的序列(288+45+687 bp)相同。

2.2 ESAT-6-MPT64融合基因及质粒pGEX-1λT的双酶切鉴定图2可见：ESAT-6-MPT64融合基因及质粒pGEX-1λT分别经双酶切后产生约1020 bp和4.9×103bp的特异性条带。

2.3重组质粒pGEX-ESAT-6-MPT64的双酶切鉴定图3可见：重组质粒经双酶切后产生两条分别约4.9×103bp和1020 bp的条带。

1～2:ESAT-6-MPT64 PCR； 3:Marker

1:双酶切的ESAT-6-MPT64融合基因；2:双酶切的pGEX-1λT； 3: Marker

1:双酶切的pGEX- ESAT-6-MPT64； 2:Marker

2.4 rBb-ESAT-6-MPT64疫苗的PCR鉴定图4可见：以rBb中抽提的质粒为模板，P1和P4为引物，PCR扩增出约1020 bp的条带，与融合基因ESAT-6-MPT64的序列完全相同。

1～4:PCR扩增产物； 5: DNA标志物

3 讨论

Sorensen等[4]用SDS-PAGE发现ESAT-6分子量为6 kD，编码基因全长288 bp，可编码95个氨基酸的蛋白质，ESAT-6是引起细胞免疫反应的重要免疫原。MPT64具有超氧化物歧化酶活性，其编码基因长687bp，可编码分子量为24KDa的蛋白质，MPT64具有CD8+T细胞表位，可诱导小鼠产生特异性细胞毒性T淋巴细胞，因此二者被选为新型疫苗构建的候选抗原。本研究采用的基因拼接法是将结核杆菌的早期分泌蛋白ESAT-6和MPT64的编码基因用含45bp的疏水性甘氨酸多肽接头连接，经PCR扩增后送上海生工公司测序，其序列与预期的序列(288+45+687=1020 bp)一致，证实成功构建ESAT-6-MPT64融合基因。该多肽接头具有一定的柔韧性和折叠性，不受内切酶位点影响，而且在表达蛋白过程中能保持抗原的稳定性，是一种操作简便、具有良好的应用价值的实验方法。pGEX-1λT是大肠杆菌-双歧杆菌穿梭载体，实验将融合基因ESAT-6-MPT64克隆入pGEX-1λT，电转化至大肠杆菌BL21，为构建重组双歧杆菌疫苗奠定了基础。

双歧杆菌是人和哺乳动物肠道内最主要的益生菌群，寄居于宿主肠道上皮，产生抗病原微生物、消除自由基、抑制肿瘤细胞和免疫调节等多种生理作用，临床上主要用于消化道疾病的辅助治疗[5]。郭志英等[6]已经构建表达胞嘧啶脱氨酶基因和内皮抑素基因的双歧杆菌疫苗，这些疫苗对肿瘤的防治已有良好的效果。本研究所构建的重组双歧杆菌- ESAT-6-MPT64疫苗有望成为预防结核病的一种新型有效的疫苗，其应用前景十分广阔，但目前该疫苗仍处于研究阶段，其安全性和有效性仍是值得关注的问题，因此多种动物的免疫保护力实验需进一步深入。

[参考文献]

[1] Kumar H，Malhotra D，Goswami S,et al.How far have we reached in tuberculosis vaccine development[J].Crit Rev Microbiol．2003,29(4):297-312.

[2] Ami Y，Izumi Y，Matsuo K，et al.Priming-boosting vaccination with recombinant Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin and a nonreplicating vaccinia virus recombinant leads to long-lasting and effective immunity[J].J Virol，2005，79(20)：12 871-12 879.

[3] 柏银兰，薛莹，王丽梅，等．结核分支杆菌ESAT6-MPT64融合蛋白的构建及应用性初步研究[J].中华实用诊断与治疗杂志，2009，23(4)：325-328.

[4] Sorensen AL，Nagai S，Houen G，et al.Purification and characterization of a low molecular mass T cell antigen secreted by Mycobacterium tuberculosis[J].Infect Immun，1995，63(5)：1 710-1 717.

[5] 李文桂,陈雅棠.双歧杆菌生物学作用研究进展[J].地方病通报,2006,21(1):85-88.

[6] 郭志英,易成,王树人,等.婴儿双歧杆菌胞嘧啶脱氨酶肿瘤靶向性基因治疗系统的构建[J].中国肺癌杂志,2004,7(2):95-98.