超短波对家兔膝关节骨性关节炎自由基代谢影响的实验研究

西安交通大学第二医院骨二科 (西安 710004) 乔鸿飞 雷建林 杨 峰

膝关节骨性关节炎(Knee osteoarthritis,KOA)从可动关节软骨的退行性变,继而发生骨质和滑膜病变为特征,软骨细胞坏死和软骨基质破坏所致的软骨降解是其主要病理环节,为中老年人易发的常见病、多发病。研究证实,自由基可在损伤软骨细胞、降解细胞外基质的同时形成自身抗原,破坏机体的耐受性,导致淋巴系统机能异常及自身免疫发生[1],同时大量研究证明过量的 NO可抑制软骨细胞合成软骨基质,增加Ⅱ型胶原裂解,抑制软骨细胞增殖[2]。本研究是在临床实践基础上,以兔实验性膝关节骨性关节炎模型,观察超短波对兔实验性膝关节骨性关节炎的血清中过氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、一氧化氮(Nitric oxide,NO)、丙 二 醛 (Malondialdehyde,MDA)、的含量变化的影响,探讨超短波防治膝关节骨性关节炎的作用机制,为临床应用和深入研究超短波作用机理提供理论依据。

材料与方法

1 实验动物及分组 日本大耳白兔体重 2.5～3kg。 6～ 8月龄,雌雄不限,西安交通大学医学院实验动物中心提供。 45只日本大耳白兔适应性喂养 1周后,按随机数字表法随机、对照、均衡的原则,分为正常对照组 10只和造模组 35只。造模组 35只动物均行右后肢膝关节伸直位固定 6周的方法造模。6周后随机抽取其中 5只行造模结果检测。确定造模成功后,将余下 30只动物随机分为空白对照组、布洛芬治疗组、超短波治疗组 ,每组 10只。

2 主要试剂仪器 NO(硝酸还原酶法)、SOD(黄嘌呤氧化酶法)和 MDA(硫代巴比妥酸缩合比色法)试剂盒(由南京建成生物工程研究所提供,批号分别为:20080125;20071026;20080116);五官超短波电疗机,波长 7.3m,工作频率 50±1.5%M Hz(WCH--B型,南京医用仪器厂);医用角度尺(规格 32×14×3cm,常州市建本医疗康复器材有限公司 )等。

3 造模方法 膝关节骨性关节炎动物模型的建立采用右后肢膝关节伸直位固定方法制作膝关节骨性关节炎动物模型[3]:右后膝长腿石膏管型固定于伸直位。固定范围:自腹股沟至趾端,踝关节背屈 60°,制动时间 6周。6周末后经病理组织学观察证实造模成功后,予拆除石膏外固定,任其自由活动。

4 治疗方法 全部实验动物专用兔饲料常规喂养。造模成功并拆除石膏外固定后,四组动物分别作如下处理:①正常对照组:仅给予常规饲养,不作任何特殊处理。②空白对照组:给予造模后常规饲养,不作任何特殊处理。③布洛芬治疗组:造模后给予布洛芬10ml/只、(临用时以蒸馏水配成混悬液:布洛芬 0.031g/ml),共 30d。④超短波治疗组:造模后进行超短波治疗。使用仪器为国产超短波机,两个直径为 9cm的圆电极于右膝关节对置,间隙 2～ 3 cm,微温量,每次治疗 20min,每日 1次,连续治疗 30次。将四组动物于治疗结束后第 30天末次用药及治疗后 1h,分组处理,先测量右后肢膝关节活动度后心脏穿刺取血以备检测一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)。

5 指标观察及检测方法

5.1 关节活动度(ROM) 测量采用量角器测量右后肢膝关节活动度。

5.2 心脏穿刺取血方法 将兔仰卧固定于兔台上,剪去心前区毛,在左侧胸壁第 3～ 4肋间,用左手食指摸到心搏最明显处,常规消毒,右手持带 10号针头的 10ml一次性注射器,从心搏最强处垂直穿刺,进针约 3cm,落空感时即有血液涌入,取血 5ml,肝素抗凝,离心分离出血清,-20℃保存,按试剂盒说明方法待测。

5.3 血清超氧化物歧化酶(SOD)测定 采用黄嘌呤氧化酶法(羟胺法)测定 SOD含量。

5.4 血清丙二醛(MDA)测定 采用硫代巴比妥(TBA)法测定 MDA含量。

5.5 血清一氧化氮(NO)测定 采用硝酸还原酶法,测定 NO含量。

6 统计学处理 各数据以平均值加减标准差(x-±s)表示,作多样本均数间两两比较,采用q检验,以P＜0.05为有显著性差异,P＜0.01为有非常显著性差异。

结 果

1 超短波对兔膝关节骨性关节炎的影响 见表1。在治疗第 1天,空白对照组、布洛芬治疗组、超短波治疗组 3组间兔骨关节活动度(ROM)无显著性差异。在第 30天经超短波治疗的兔膝关节活动度(ROM)明显改善,与空白对照组、布洛芬治疗组比较均具有极显著性差异(P＜0.01),表明超短波治疗能够改善骨关节炎所致膝 ROM的改变。

表1 骨关节活动度测定

表1 骨关节活动度测定

注:与同阶段正常组比较 ,①P＜0.01;与同阶段空白对照组比较,②P＜0.01;与同阶段布洛芬治疗组比较,③P＜0.01

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2 血清一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)及血清丙二醛(MDA)测定 见表 2。超短波对兔膝关节骨性关节炎的影响可使超短波治疗组的血清SOD活性增加、MDA水平下降,并抑制 NO的升高,与空白对照组、布洛芬治疗组比较均具有极显著性差异(P＜0.01),表明超短波在治疗骨性关节炎时具有抑制 NO的产生,消除自由基、改善骨性关节炎的炎症反应作用。

表2 超短波对骨关节炎兔血清 NO、SOD和 MDA含量的影响

表2 超短波对骨关节炎兔血清 NO、SOD和 MDA含量的影响

注:与同阶段正常组比较,①P＜0.01;与同阶段空白对照组比较,②P＜0.01;与同阶段布洛芬治疗组比较,③P＜0.01

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讨 论

骨性关节炎(Osteoarthritis,OA)是一种多发的、极大危害老年人健康的慢性进行性骨关节病。目前虽已明确 OA是由多种因素造成关节软骨破坏所致,但对其确切的发病原因尚不完全清楚。对该病的治疗除了关节清理术、截骨术、关节置换等手术疗法以外,主要是物理治疗以及给予对症药物缓解症状[4]。氧自由基是机体通过酶系统和非酶系统产生,过量的氧自由基可对氨基酸多肽及蛋白质进行化学修饰,改变其结构及功能,促使降解,使细胞膜发生脂质过氧化,成为许多疾病发生的基础。在 OA患者体内氧自由基含量增高,这主要可能是在免疫反应核吞噬过程中产生和或关节内产生的细胞因子刺激软骨细胞和滑膜细胞超常产生大量自由基[5]。氧自由基损伤是关节衰老和变性的重要因素,过量的氧自由基抑制软骨细胞增殖,引起软骨细胞死亡,抑制软骨基质胶原和蛋白多糖的合成,加速软骨降解,导致软骨的损伤[6,7]。血清MDA和 SOD的水平可间接地反映体内脂质过氧化反应的状况。SOD是为防御新陈代谢及其它生命活动中产生的氧自由基(Oxygenfree radical,OFR)对机体损伤和破坏,在组织和细胞中建立和形成一套完善的抗氧化防御体系中的一种重要金属酶,对氧自由基代谢保持平衡起着至关重要的作用,也是体内 OFR清除系统的首要防线。SOD对细胞损伤具有保护作用,一旦炎症发生,SOD在反应中大量消耗,必然含量降低。因此,SOD含量的高低间接反映机体清除 OFR的能力。SOD为超氧阴离子的清除剂,MDA是脂质过氧化的产物,二者是检测机体血氧自由基水平的常用配对指标,氧自由基参与 OA的病理过程,通过对软骨基质生理功能的改变,进而使软骨细胞退变、死亡[8,9]。SOD活力的高低间接反映机体清除氧自由基的能力,而 MDA含量的高低又间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度,二者可作为动态评价 OA防治效果的客观指标。NO是一种不稳定的自由基,具有广泛的生物学作用,其含量与病情的严重程度成正相关[10]。

因此,有研究者认为研制能降低骨性关节炎关节液中 NO水平的药物是治疗骨性关节炎的一条理想途径。在本试验中,超短波能作用于机体深层组织,进一步改善其血液循环,以促进渗出物的吸收、降低关节周围及韧带的张力,有利于改善关节软骨的营养供给,使软骨损伤的部位得以有效修复,同时还有很好的止痛功效。超短波治疗可以促进炎性渗出物及代谢废物排泄加快,使局部肌张力降低、疼痛缓解,还可以改善局部微循环,缓解静脉淤滞导致的骨内高压,延缓骨性关节炎病理变化过程[11]。本实验研究结果表明,超短波能显著降低骨性关节炎兔血清中升高的 NO和MDA含量,增加 SOD含量。布洛芬治疗组对骨性关节炎兔血清 NO、MDA和 SOD的作用与空白对照组相似。同超短波治疗组有显著差异。综上所述,超短波能延缓和抑制骨性关节炎兔软骨退行性改变和滑膜炎症,具有防治骨性关节炎的作用,其机制可能与降低血清中 NO和 MDA含量、激活 SOD活性从而提高抗氧化能力有关。

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