三拗芎葶合剂对哮喘大鼠肺 NGF表达作用研究

荆 阳 杨仁旭 贾晓鑫 成都中医药大学 (成都 610075)

支气管哮喘是一种严重威胁人类健康的慢性呼吸道疾病,近年来其发病率和死亡率呈上升趋势。最近研究提示在哮喘发病机制中,免疫细胞与神经元之间存在着广泛的联系,而神经生长因子(NGF)不仅可调控神经发育、存活及维护其功能,也参与免疫炎症调控,以及复杂的神经-免疫相互作用,被认为是参与这一免疫神经机制的重要介质。中医药对哮喘的防治具有丰富的经验和良好的效果,三拗芎葶合剂是杨仁旭教授治疗哮喘有效的经验方,本实验通过观察哮喘大鼠肺 NGF表达和三拗芎葶合剂对 NGF表达的影响,旨在探讨 NGF在哮喘发病机制中的作用及三拗芎葶合剂防治哮喘的作用机制,为中医药治疗哮喘提供可靠的新的依据。

1 材料和方法 1.1 实验动物与分组 SD大鼠 60只,体重 160-180g(由成都中医药大学动物实验中心提供)。随机分为空白对照组、哮喘模型组、三拗芎葶合剂低、中、高剂量组、地塞米松组 6组。

1.2 药物及试剂 三拗芎葶合剂:(麻黄 10g、杏仁 15g、川芎 15g、葶苈子 30g)由四川省中药材公司提供合格药材,经成都中医药大学附属医院药剂加工厂煎煮、回收挥发性成分、浓缩制备(每 1mL药液含生药 2g)。地塞米松注射液由西南药业提供,给药剂量 1mg/kg。大鼠 NGF原位杂交和免疫组化试剂盒由武汉博士德生物工程公司提供。

1.3 实验方法 取健康 SD大鼠 60只,随机分为空白组、哮喘模型组、三拗芎葶合剂低、中、高剂量组、地塞米松组 6组,每组 10只。除空白组以外的五组大鼠于第 4d和第 11d腹腔内注射 10%卵白蛋白 (OV A)混合抗原液 1mL(含OV A100mg和氢氧化铝干粉 100mg)致敏,第 3周起将大鼠置于密闭玻璃盒内,空白组大鼠用生理盐水,其余组用超声雾化器喷入 1% OV A溶液 30min激发哮喘,同时采用三拗芎葶合剂高剂量组 2mL(中药 20g/kg)、中剂量组 1mL(中药 10g/kg)稀释为 2mL、低剂量组 0.5mL(中药 5g/kg)稀释为 2mL灌胃,1d1次;地塞米松组采用地塞米松注射液 5mg(规格 5mg/mL)稀释为 50mL,每只鼠腹腔注射 2mL(1mg/kg),1d1次。 2周后处死大鼠,取右肺组织,固定石蜡包埋。

1.4 观察指标 1.4.1 病理形态学:HE染色光镜观察并在高倍镜下,测定单位面积支气管粘膜和粘膜下嗜酸粒细胞(EO S)数和淋巴细胞(L)数。

1.4.2 支气管肺组织 NGF的测定:石蜡切片经常规处理后 ,滴加正常山羊血清室温封闭 20min,然后按酶标亲和素-生物素技术(SP)法进行免疫组织化学反应,按照说明书操作。用图像分析系统对实验结果进行图像分析,计算出光密度值

1.4.3 支气管肺组织 NGFmRN A的测定:石蜡切片经常规处理后 ,测定支气管肺组织 NGFmRN A,按照说明书操作。图像分析系统对实验结果进行图像分析,计算出光密度值。

2 结 果 2.1 肺 HE染色 空白组大鼠细支气管纤毛排列整齐,管腔圆整,血管腔、肺泡腔、肺间质偶见炎性细胞的浸润,基底膜较薄,哮喘组大鼠气道壁和肺组织中可见以嗜酸性粒细胞、淋巴细胞为主大量炎症细胞浸润,支气管黏膜皱襞增多延长 ,支气管管壁增厚、管腔狭窄,支气管管壁及平滑肌较对照组明显增厚,中药小剂量组大鼠支气管管壁增厚、管腔狭窄,支气管管壁及平滑肌增厚有所减轻,炎性细胞侵润减少,地塞米松组和中药中、大剂量组大鼠细支气管纤毛排列较整齐,管腔较圆整,血管腔、肺泡腔、肺间质偶见到 EOS的浸润,并可见少量淋巴细胞浸润,基底膜增厚减轻。

2.2 EOS和淋巴细胞计数 表 1结果显示:模型组EOS数和淋巴细胞数明显高于空白组 (P＜0.01),中药低、中、高剂量组及激素组均低于模型组 (P＜0.01),中药中、高剂量组与地塞米松组相近,无显著差异(P＞0.05)。

2.3 N GFmRNA和 NGF蛋白的表达 表 2结果显示:模型组 N GF蛋白及其 mRAN表达明显高于空白组 (P＜0.01),中药低、中、高剂量组及激素组 NGF蛋白含量低于模型组(P＜0.01),其 mRAN表达明显弱于模型组(P＜0.01),中药中、高剂量组 N GF蛋白及其 mRNA表达与地塞米松组相近,无显著差异(P＞ 0.05)。

表1 各组单位面积支气管粘膜和粘膜下EOS数和淋巴细胞(L)数 (±s)

表1 各组单位面积支气管粘膜和粘膜下EOS数和淋巴细胞(L)数 (±s)

注:与空白组比较△P＜0.01,▲P＜0.05;与模型组比较◇P＜0.01,◆P ＜0.05;与激素组比较□P ＜0.01。

组 别 n EOS L空白组 10 2.07± 1.05 8.53± 2.12模型组 10 25.43±5.07△ 36.17± 6.02△中药低剂量组 10 14.97± 3.29△◇□ 26.90± 5.23△◇□中药中剂量组 10 8.54± 3.30△◇ 16.44±3.52△◇中药高剂量组 10 7.39± 2.48△◇ 14.82±2.26△◇地塞米松组 10 5.95±2.37△◇ 12.99±2.96▲◇

表2 各组大鼠肺组织 NGF及 NGFmRN A阳性反应产物平均光密度值比较(±s)

表2 各组大鼠肺组织 NGF及 NGFmRN A阳性反应产物平均光密度值比较(±s)

注:与空白组比较△P＜0.01,▲P＜0.05;与模型组比较◇P＜0.01,◆P ＜0.05;与激素组比较□P ＜0.01。

组 别 n NGFmRN A NGF空白组 10 0.140± 0.031 0.124± 0.022模型组 10 0.406±0.061△ 0.386±0.049△中药低剂量组 10 0.342±0.053△◇□ 0.323± 0.056△◇□中药中剂量组 10 0.225± 0.029△◇ 0.218± 0.027△◇中药高剂量组 10 0.213± 0.030△◇ 0.209± 0.036△◇地塞米松组 10 0.190± 0.042△◇ 0.202± 0.031△◇

讨 论 哮喘的基本病理改变为气道炎症,气道炎症是引起气道高反应性。气道炎症的神经源性因素日益受到重视。神经生长因子是神经元细胞生长和分化的营养因子,近来发现NGF能影响机体的免疫系统,与变态反应性和炎症性疾病的发病有关[1]。N GF的产生一般由神经系统细胞产生,但在炎症条件下,大量非神经细胞也可产生 NGF,包括肥大细胞、嗜酸粒细胞、T细胞和 B细胞。同时发现 N GF能作用于免疫炎性细胞,促进其增殖、分化、存活及介导、促进炎症介质释放 ,参与炎症反应,加重气道炎症反应[2-4]。目前研究表明,哮喘患者血清或 BALF中神经营养因子水平增高的同时伴有 AHR存在[5]。最近又发现抑制 NGF能够抑制支气管的收缩,阻断气道高反应性的发生[6]。因此,可认为 NGF是联系气道免疫与神经机制、导致气道高反应性的重要物质。一方面,NGF可通过对气道神经系统的影响,介导气道高反应性;另一方面,NGF也可通过神经源性炎症和“放大”免疫细胞效应参与气道炎症的形成[7]。因此,NGF是连接气道炎症和气道高反应性的一座桥梁。

三拗芎葶合剂由麻黄、川芎、杏仁、葶苈子组成。麻黄苦辛性温,宣肺平喘、利水之功;川芎辛温 ,活血化瘀行气 ,为血中之气药 ,通过治气活血而使痰消饮祛 ,肺脉自宁;杏仁苦微温,降肺气之中兼宣肺止咳平喘之用;麻杏相伍 ,一宣一降 ,以恢复肺气之宣降,顺肺之生理特性,加强宣肺平喘之功;葶苈子苦辛大寒,泻肺平喘、利水消肿。提示三拗芎葶合剂可能通过抑制 N GF表达,减少炎性细胞分泌,来干预气道炎症,从而到达治疗哮喘的目的。

[1] 钟雪莺,龙 发,张永昶.神经生长因子与哮喘气道炎症 [J].国际呼吸杂志 ,2006,26(5):329-330.

[2] Antonelli A,Lapucci G,Vigneti E,et al.Human lung fibroblast response to NGF,IL-1beta,and dexamethsone.Lung,2005,183(5):337-351.

[3] Pons F,Freund V,Kuissu H,et al.Nerve growth factor secretion by human lung epithelial A549 cells in pro-and anti-inflammatory conditions.Eur J Pharmacol,2001,428(3):365-369.

[4] Kemi C,Grunewald J,Eklund A,et al.Differential regulation ofneurotrophin expression in human bronchial smooth muscle cells.RespirRes,2006,7:18.

[5] Kassel O,de Blay F,Duvernelle C,et al.Local increase in the number ofmast cells and expression of nerve growth factor in the bronchus of asthmatic patients after repeated inhalation of allergen at low-dose.ClinExp Allergy,2001,31(9):1432-1440.

[6] Frossard N,Naline E.Olgart Hglund C,et al.Nerve growth factor is released by IL-1beta and induces hyperresponsiveness of the human isolated bronchus.Eur Respir J,2005,26(1):15-20.

[7] 周 敏 ,徐永健,张珍祥.神经生长因子在哮喘发病中的作用[J].国外医学呼吸系统分册,2002,22(6):300-301.