六味地黄生物制剂延长果蝇寿命及抗氧化作用的研究*

夏少秋 朱 颖 吴亚军 宋 涛 赵 越 广东药学院中药学院 (广东 510006)

六味地黄汤(Liuweidihuang Decoction,简称 LW)由熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、牡丹皮、茯苓等六味传统中药组成。现代药理研究表明,该方具有抗衰老、调节免疫和内分泌的作用[1]。六味地黄生物制剂 (LiuweidihuangDecoction Metabolized by Photosynthetic bacteria,简称 LW-PSB)是将优选的光合细菌作为菌种,引入到六味地黄汤中进行代谢,通过光合细菌的生物转化功能和自身营养价值的利用,制备出的新型中药生物制剂。研究表明,六味地黄生物制剂在增强免疫,治疗肾阴虚证模型老鼠[2]等方面要优于传统的六味地黄汤。为了研究六味地黄生物制剂抗衰老作用及其抗衰老机制,本文首次以果蝇为研究对象,考察六味地黄生物制剂对果蝇寿命、抗氧化能力的影响,为该生物制剂的深入开发和利用提供依据。

1材料与方法 1.1实验动物 美国野生型黑腹果蝇(Drosophila melanogaster),华南农业大学生命科学院提供。收集 8 h内羽化未交配果蝇,雌雄分开,用基础培养基在温度为(25±1)℃,相对湿度为(60±5)%环境中培养。间隔 12h给予光照。

1.2 六味地黄汤(LW)的制备 熟地黄、山药、山茱萸、泽泻、牡丹皮、茯苓按处方的比例(8:4:4:3:3:3)配药。加 8倍量的水,文火煎煮 1.5 h,滤过。药渣再加 6倍量的水煎煮 1.5 h,滤过。合并滤液,浓缩至 0.5g/mL备用。

1.3 六味地黄汤生物制剂的制备(LW-PSB) 按上述方法制备的六味地黄汤经自然发酵后,按一定比例加入光合细菌,于光照培养箱中培养,6个后即得。所制备的药液含生药材量同上,活菌数为 109个 /mL。

1.4 实验用培养基 培养基 I:为基础培养基,其主要成分:水 180mL,白糖 13g,琼脂 1.3g,玉米粉 17g,酵母粉 1.4 g,丙酸 1 mL。以六味地黄生物制剂(上述制备)占培养基(0.3%,0.9%)的含量加入到基础培养基中,依次配成培养基Ⅱ,Ⅲ。以 10mg/100g的量将维生素 C加入到基础培养基中配成培养基Ⅳ。

1.5 仪器与试剂 岛津 UV-2450紫外可见分光光度计(日本岛津公司),AnKe TDL80-2B离心机(上海安亭科学仪器厂),BOXUN SPX-250B-Z型恒温培养箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂),GSH-PX,T-AOC,SOD,CAT检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所,计量单位分别为 U/mgprot,U/mgprot,U/mgprot,U/gprot。广口三角瓶(50 mL),白砂糖、玉米粉由超市购买,其他试剂均为分析纯。

1.6 实验方法 1.6.1果蝇寿命实验:收集 8h内新羽化黑腹果蝇成虫,乙醚麻醉分雌雄;在基础培养基中饲养 20d后,随机分组试验。每组果蝇 400只,雌雄各半。每 4天更换新鲜培养基。实验开始后,每天定点观察,记录果蝇死亡数,直到各组果蝇全部死亡为止。前半数果蝇生存时间的均数为半数死亡时间,全部果蝇寿命的算术平均数为平均寿命 ,最后 10只果蝇寿命的算术平均数为最高寿命,统计各组果蝇半数死亡时间,平均寿命,最高寿命。

1.6.2 GSH-PX、T-AOC、SOD、CAT的测定:收集 8h内新羽化黑腹果蝇成虫,乙醚麻醉分雌雄,随机分组试验。每组果蝇 1000只 ,雌雄各半。每 4d更换新鲜培养基。在给药后第 30d时,制成 8%的组织匀浆;以 4000r/min离心 10min,取上清液待测。按照试剂盒说明测定每组上清液 GSH-PX、T-AOC、SOD、CAT活性。

2 结 果 2.1果蝇寿命试验 根据《中国保健食品的进展》中延缓衰老功能的检测方法来判定,果蝇生存实验的评价指标有最高寿命、平均寿命和半数死亡时间 3种。如果任一剂量组(或二组、三组 )的任一性别(或两性)的最高寿命和(或)平均寿命显著长于对照组,即可判定实验样品对果蝇有延缓衰老功能[3]。

表1 六味地黄生物制剂对雌性果蝇寿命的影响(±SD)

表1 六味地黄生物制剂对雌性果蝇寿命的影响(±SD)

注:各浓度组与空白对照组比较△P＜0.05,▲P＜0.01,◇P＜0.001;各浓度组与阳性对照组比较◆P＜0.05。

组 别 数量 /只半数死亡时间/d最高寿命/d平均寿命/d空白对照组 174 40.17± 8.45 59.60±1.43 47.29±9.60 0.3PSB-LW组 197 40.78± 7.51 60.90± 1.20△ 47.67±9.08 0.9PSB-LW组 177 43.73± 6.03▲◆ 62.70± 0.67◇ 49.79± 7.99▲Vc组 196 41.65± 5.49 63.40± 1.90◇ 48.19± 8.17

由表 1表 2可知,与空白对照组比较,所有雌性实验组最高寿命均高于空白对照组,差异有显著性(P＜0.05或 P＜0.001),在 0.9%组还延长了果蝇的半数死亡时间和平均寿命,差异极为显著(P＜0.01)。并且呈现出剂量-效应关系。在雄性实验组中,与空白对照组相比,延长了 0.3%浓度组的半数死亡时间、平均寿命以及最高寿命,差异有显著性 (P＜0.01或 P＜0.001)。但 0.9%浓度组与空白对照组没有显著性差异,说明对六味地黄生物制剂的反应存在着性别差异,这一现象可能与雌雄果蝇不同的生理代谢过程有关,其原因机理需要进一步研究。总的来说,通过对果蝇寿命的实验研究充分表明,六味地黄生物制剂延长了果蝇的半数死亡时间、最高寿命和平均寿命,具有良好的抗衰老作用。

表2 六味地黄生物制剂对雄性果蝇寿命的影响(±SD)

表2 六味地黄生物制剂对雄性果蝇寿命的影响(±SD)

注:各浓度组与空白对照组比较△P＜0.05,▲P＜0.01,◇P＜0.001;各浓度组与阳性对照组比较:◆P＜0.05。

组 别 数量 /只半数死亡时间/d最高寿命/d平均寿命/d空白对照组 194 43.49± 6.75 62.00±1.41 49.74±8.21 0.3 PSB-LW组 185 46.89± 7.64▲◆ 64.20± 1.23◇ 52.76± 8.17▲◆0.9PSB-LW组 193 43.86± 7.15 61.20±0.42 50.83±8.83 Vc组 188 42.84± 6.34 64.90± 1.45◇ 50.31±9.29

2.2 果蝇 T-AOC、GSH-PX、SOD、CAT的活性测定 由表 3显示,跟空白对照组比较,各剂量组的雌雄果蝇的相关测试抗氧化酶均有显著性差异(P＜0.05、P＜0.01或 P＜0.001)。各剂量组与 Vc组比较,雌雄果蝇的相关测试抗氧化酶也均有显著性差异(P＜0.05),实验还明确显示六味地黄生物制剂对各剂量组雌性果蝇的效果要优与雄性果蝇,全部显示出性别差异(P＜0.001)。综上结果表明,六味地黄生物制剂显著的提高了果蝇体内抗氧化酶系的活性,增强了果蝇的抗氧化能力,延缓了果蝇的衰老。

表3 六味地黄生物制剂对果蝇 T-AOC、GSH-PX、SOD、CAT的影响(n=6,±SD)

表3 六味地黄生物制剂对果蝇 T-AOC、GSH-PX、SOD、CAT的影响(n=6,±SD)

注:各浓度组与空白对照组比较:△P＜0.05,▲P＜0.01,◇P＜0.001;各浓度组与阳性对照组比较:◆P＜0.05。

组 别 性别 T-AOC/U/mgprot GSH-PX/U/mgprot SOD/U/mgprot CAT/U/gprot空白对照组 ♀ 2.21±0.09 7.29±1.58 38.15±0.58 119.85±27.31♂ 1.65± 0.05 23.97± 3.52 44.74± 0.95 194.30± 21.19 0.3 PSB-LW组 ♀ 2.85± 0.10◇ 87.71± 4.56◇◆ 63.27± 7.96◇◆ 446.19±58.80◇◆♂ 8.10± 0.33◇◆ 30.11± 7.17△ 85.46± 14.12◇◆ 459.57± 64.28◇◆0.9 PSB-LW组 ♀ 4.59± 0.36◇◆ 187.22±9.57◇◆ 74.16± 16.52◇◆ 594.33±82.12◇◆♂ 4.32± 0.05◇◆ 35.71± 3.93▲ 39.51± 3.47 281.46± 50.80△◆Vc组 ♀ 2.76± 0.08◇ 18.19± 2.07▲ 34.04± 0.95 122.43±34.78♂ 1.78±0.06 45.71± 4.00◇ 39.62±0.81 138.68±24.09

3 讨 论 衰老是人类面临的重大难题之一,它是机体各种功能退化和紊乱的表现。本文采用果蝇为实验对象,通过寿命实验,酶实验来考察六味地黄生物制剂的抗衰老作用。果蝇是一种真核多细胞生物,具有高度纯种,生存期短,繁殖能力强,观察指标明显等诸多优点,果蝇与人类在身体发育、神经退化、肿瘤形成等方面的机制,都有许多相通之处[4],因此果蝇是研究抗衰老药物及其作用基础的好材料。

寿命实验是通过观察药物对生物整体生存过程的影响,特别是对动物半数死亡时间、平均寿命和最高寿命的影响,以确定其延缓衰老效应的方法。寿命试验在延缓衰老的研究中是一个极为重要的研究项目。本实验结果表明,六味地黄生物制剂不同浓度都有延长雌雄果蝇寿命的作用。对雄果蝇而言,0.3%浓度效果优于 0.9%浓度;对于雌果蝇,0.9%浓度效果最显著。显示出性别差异,这可能与雌雄果蝇不同的生理代谢过程有关。这一结果与很多中药的抗衰老实验结果相吻合。试验提示长期使用抗衰益寿药物可能以小量为宜,至于对其他动物的延寿作用是否也存在浓度差异的现象还有待进一步论证。

关于衰老有许多理论和假说,其中自由基理论是衰老理论中的一种重要学说。该学说随着年龄的增长,体内抗氧化酶活性降低,导致自由基反应增强而诱发了过多的有毒性的过氧化物堆积而加速衰老[5],同时还发现与机体的抗疲劳密切相关[6]。体内自由基清除系统如 SOD能清除 O2-,CAT能清除 H2O2,GSH-PX能还原过氧化物,从而维持自由基产生和清除的平衡[7]。因此,提高内源性抗氧化酶的活性 (GSH-PX、T-AOC、SOD、CAT)清除体内自由基是抗衰老的一种途径。实验结果表明,六味地黄生物制剂主要表现出提高了果蝇体内 SOD,GSHPX,T-AOC,CAT的活性,但是不同酶的活性在雌雄果蝇间存在差异,这可能是物质作用的各个抗氧化酶“靶”数量有性别差异,也可能是生物体存在选择性 (如吸收的选择性等)。

综上所述,六味地黄生物制剂可通过提高内源性抗氧化酶活性,清除自由基的途径来增强果蝇抗氧化能力,延缓衰老过程,延长果蝇寿命。

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