粉葛有效部位提取工艺实验研究*

2010-04-25 10:45严建业陕西中医学院药学院咸阳712046
陕西中医 2010年6期
关键词:浸膏葛根素定容

孙 静 钱 平 严建业 陕西中医学院药学院(咸阳 712046)

粉葛为豆科植物甘葛藤 Pueraria thomsonii Benth.的的干燥根,具有解肌退热,透疹,生津止渴,升阳止泻的功效。葛根的有效部位为其所含的异黄酮类物质,如大豆苷、大豆苷元、葛根素等。其中葛根素(puerarin)是本属的特有成分,也是主要的有效成分。近年来国内对葛根所含化学成分的药理作用和临床应用方面的研究不断增加。研究表明[1],葛根煎剂、浸提剂和总黄酮都有一定的降压效果。目前葛根异黄酮的提取方法[2]主要有铅盐沉淀法,不同浓度的甲醇、乙醇回流和冷浸提取法,水饱和正丁醇冷浸法,水饱和正丁醇萃取—硅胶柱层析等。结合生产实际,选择乙醇回流法提取葛根有效部位,得到科学合理的工艺参数,为该药材大生产的应用进一步奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 实验仪器 调温电热套(型号:ZDHW河北省黄骅市中兴仪器有限公司);电子恒温水浴锅(型号:GKC-11-CR2上海金桥科析仪器厂);远红外快速恒温干燥箱(型号:YHG-40×45上海跃进医疗器械厂);高效液相色谱仪(Waters 600 Controller,Waters 600Pump);紫外检测器(Waters2478Dual λ Absorbance Detector)。

1.2 药品与试剂 根购自西安盛兴中药饮片有限责任公司(批号:20060330来源:广西 ),经鉴定为豆科植物甘葛藤的根,习称粉葛;葛根素化学对照品(0752-9907中国药品生物制品检定所);无水乙醇(洛阳市化学试剂厂)为分析纯;水为自制的蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 正交实验设计 影响乙醇回流提取效果的因素有乙醇浓度、溶剂用量、回流时间和提取次数,根据资料对每个因素选取 3个不同水平,进行正交实验优选提取工艺,见表 1。

表1 因素水平表

2.2 供试品的制备 将葛根碾成粗粉,称取50g,共 9份,分别置于 1000mL圆底烧瓶中并标记,然后按照表 2的正交实验设计方案进行回流提取,合并提取液并过滤,滤液回收乙醇,水浴蒸至近干,然后放入烘箱中 80℃干燥 50个 h,可得到深棕色干浸膏。将干浸膏置于干燥器中冷却至室温,精密称重。

2.3 葛根素的含量测定

2.3.1 对照品溶液的配制:精密称取葛根素化学对照品 0.0112g,用 30%乙醇溶解,定容至 25mL,摇匀。精密移取该溶液 2mL置 10mL容量瓶中并用 30%乙醇定容,最后用 0.45 μm微孔滤膜滤过,摇匀,即得浓度为 0.0896mg/mL葛根素对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液的配制:精密称取各干浸膏20mg,用 30%乙醇溶解,定容至 10mL,摇匀,用 0.45 μ m微孔滤膜滤过,标记,即得各供试品溶液。

2.3.3 供试品溶液的测定:色谱条件:Kromasil色谱柱 250×4.6mm,填充剂:十八烷基硅烷键和硅胶 ,流动相:乙腈 -水 (14∶ 86),流速:1.00mL/min,检测波长:250nm。

精密吸取对照品溶液和供试品溶液各 10 μ l,分别注入液相色谱仪,所得结果如表 3所示。

表3 HPLC测定数据表

2.3.4 测定数据的处理:由已知数据可计算出葛根素对照品溶液的浓度为 89.6 μ g/mL,利用外标法公式[4]计算出供试品溶液中葛根素的含量。

已知供试品溶液的浓度和供试品溶液中葛根素的浓度,经计算可得出浸膏中葛根素的含量。以所得浸膏重量(x)最高者 5.2625g计 30分,以浸膏中所含葛根素总量(y)最高者 66.15mg计 70分,可得综合评分(z)=30x/5.2625+70y/66.15。以综合评分为(z)指标进行极差(R)的计算及方差分析,结果见表 4、5。

表4 正交实验表

表5 方差分析表

当 α=0.05时 ,F α(2,2)=19.00,则 A、 D两因素的 F值满足 P{F(2,2)> F α(2,2)}=0.05,此二因素三个水平的变动对实验结果的波动影响较大,有显著性;当 α=0.01时 ,F α(2,2)=99.00,则只有 A因素的F值满足 P{F(2,2)> F α(2,2)}=0.01,该因素水平的变动对实验结果的波动影响非常大,极显著。

由于正交表上的各列刚好填满,故选取方差来源中离差平方和最小的一个近似作为误差的估计,即SSe≈ SSB=49.85,fe=2。

2.4 结果 由极差 R的计算可看出 RA>RD> RC> RB,即对该工艺影响最大的因素是乙醇浓度,其次是提取次数、回流时间,溶剂用量影响最小。

由表 4可知最佳提取工艺是 A1B2C2D2。由于经方差分析得知 B、C二因素不显著,所以考虑到生产实际的需要,可以选用工艺 A1B1C1D2。

2.5 验证性实验 将葛根碾成粗粉,称取 50g,共 3份,置于 1000mL圆底烧瓶中并标记,然后按照优选的 A1B1C1D2工艺条件进行回流提取,合并提取液并过滤,滤液回收乙醇后在 100℃水浴上蒸至近干,然后放入烘箱中 80℃干燥 50个小时,可得到深棕色干浸膏。将干浸膏置于干燥器中冷却至室温,精密称重,所得干浸膏重量分别为:①4.5364g② 4.9525g③4.8367g精密称取各干浸膏 20mg,用 30%乙醇溶解,定容至 10m L,摇匀,用 0.45 μ m微孔滤膜滤过,标记即得验证性试验的各供试品溶液。用 HPLC法测定各供试品溶液中葛根素的含量(色谱条件同前),经计算可得出各浸膏中葛根素的含量:①65.32mg②69.83mg③67.23mg结果表明采用工艺 A1B1C1D2提取葛根有效部位,效果较好。

3 结 语 乙醇回流法是提取葛根黄酮的一种经典方法,提取效率高,与使用其他有机溶剂提取相比具有安全环保、经济、简便易行的特点,与水煎煮法相比具有提取物纯度较高的优点,在实际生产中使用较广泛。本文通过 L9(34)正交实验和验证性实验优选出乙醇回流法提取葛根有效部位的工艺条件,即采用6倍量 70%的乙醇,提取 2次,每次 1h,工艺可行,适合工业应用。

[1] 沈映君.中药药理学[M].上海:上海科学技术出版社,1997:36-38.

[2] 张梦军 ,吴世容,李志良.几种提取葛根异黄酮的方法比较及实验优化 [J].中成药,2005,27(10):1133-1135.

[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典一部.2005版[M].北京:化学工业出版社 ,2005:233-234.

[4] 张广强 ,黄世德.分析化学 (下册 仪器分析)[M].北京:学苑出版社,2001:376.

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