大鼠全脑缺血再灌注时依托咪酯对 BcL-2和相关因子的关系

王新程,王进全

(1.佳木斯大学附属第一医院,黑龙江 佳木斯 154003;2.佳木斯大学2008级研究生,黑龙江 佳木斯 154003)

依托咪酯(etomidate)作为一种新型的静脉麻醉药,静脉注射后大约1min脑内浓度达到最大,最大效应发生在3min,为快速催眠性静脉全身麻醉药。动物研究证明,依托咪酯的作用有部分可通过对脑干网状系统的抑制和激活作用。对心血管和呼吸系统影响较小,可用于休克或创伤患者的全麻诱导,不增加组胺释放,可降低脑内压、脑血流和眼内压的特点。该药在不影响平均动脉压的条件下脑血流和脑氧耗呈剂量依赖性降低,对颅内压降低时平均动脉压并不降低,对缺血缺氧性脑损伤有保护作用。本实验就依托咪酯对缺血缺氧性脑损伤时,Bcl-2和相关因子的关系展开探讨。

1 材料和方法

1.1 材料

Bax兔抗鼠单克隆抗体(SC-526),Bcl-2兔抗鼠多克隆抗体(SC-492),Caspase-3兔抗人多克隆抗体 (SC-7148),二步法免疫组织化学检测试剂(PV-9001),DAB显色剂 (ZLI-9018),(TUN EL)原位细胞凋亡检测 (ZK-8005)。以上试剂均购于武汉博士的生物科技有限公司。依托咪酯注射液(江苏恒瑞医药股份有限公司)。

1.2 试验方法

雌性 Wistar大鼠 65只 ,体重 280～ 310g,鼠龄 3～ 4个月 ,由佳木斯大学实验动物中心提供。随机分为3组:对照组(C=5),生理盐水(S=30),依托咪酯组(E=30);生理盐水组和依托咪组又根据再灌注的时间不同分为再灌注1h,6h,12h,24h,48h,72h亚组。

1.3 模型制备

采用大鼠四条血管阻断方法(Pulsinelli-4VO)[1]制备大鼠全脑缺血再灌注模型。大鼠用10%水合氯醛350mg/kg腹腔注入麻醉后,将大鼠俯卧固定 ,备皮,消毒。在枕骨下于平行脊柱沿颈背正中线切开皮肤,皮下肌肉至第一颈椎,找到后弓上的翼突孔,按其解剖位置将烧灼的细针直接插入双侧翼突孔,插入时间在 2～ 3s即可。并电凝烧闭椎动脉;次日用同样的麻醉方法处理大鼠后,在颈部正中切口,于双侧颈动脉鞘出分离双侧颈动脉,在双侧颈动脉环绕丝线并提出颈动脉,用临时阻断夹夹闭颈总动脉造成全脑缺血20min,20min后松开阻断夹恢复再灌注。E组于缺血前30min腹腔注入依托咪酯0.3mg/kg,NS组在缺血前30min腹腔注入等溶剂的生理盐水。C组不电凝双侧椎动脉,不夹闭双侧颈总动脉,其余处理与手术组相同。

于再灌注时间点麻醉动物,迅速剪开胸腔暴露心脏,于心尖处剪一小口,插入软管至主动脉,丝线结扎固定,剪开右心耳快速向心脏推注肝素化生理盐水,冲净血液后,以4%多聚甲醛灌流30min,断头取脑,由视交叉平面冠状切取约 4mm组织块,置4%多聚甲醛固定,脱水,透明,石蜡包埋 ,切片机做连续冠状面切片。

1.4 神经功能缺陷评分

[2]评分标准进行行为评分。0分:正常 ,无神经缺陷征象;1分:不能完全伸展右前肢;2分:行走时向右侧转圈;3分:行走向右侧跌到;4分:不能行走,意识水平下降。累计1分以上就为模型成功。

1.5 免疫组化及 TUN EL法检测

免疫组化法检测 Bax,Bcl-2,Caspase-3蛋白在大鼠海马 CA1区的表达情况。TUN EL法检测其细胞的凋亡数。

1.6 数据收集

于 400倍光镜下计数 CA1区细胞总数和阳性细胞数,计算阳性率(阳性率=阳性细胞数 /总细胞数×100%)。每张切片计数4个不重叠视野,取平均值。

1.7 统计学处理

采用 SPSS17.0软件进行统计处理,数据均用均数±标准差表示。组间比较采用方差分析。P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

见表 1。

表1 各组海马区 Bcl-2,Bax,Caspase-3及 TUN EL阳性细胞数 (±s)

表1 各组海马区 Bcl-2,Bax,Caspase-3及 TUN EL阳性细胞数 (±s)

①BcL-2组间比较:S1V S E1,S2VS E2,S3V S E3,S4V S E4,S5VS E5,S6V S E6(P＜0.05);S1VS S2,S3,S4,S5,S6(P＜0.05);S3,VS S4,S5,S6(P＜ 0.05)。②Bax组间比较:S1VS E1,S2V S E2,S3V S E3,S4V S E4,S5VS E5,S6V S E6(P＜0.05);S1VS S2,S3,S4,S5,S6(P ＜ 0.05);S3V S S4,S5,S6(P ＜ 0.05)。③ Caspase-3组间比较:S1V S E1,S2V S E2,S3V S E3,S4V S E4,S5VS E5,S6V S E6(P＜0.05);S1VS S2,S3,S4,S5,S6(P ＜0.05);S3,VS S4,S5,S6(P＜0.05)。④TUN E组间比较:S1VS E1,S2VS E2,,S3V S E3,S4 V S E4,S5 V S E5,S6 V S E6(P＜0.05);S1 V S S2,S3,S4,S5,S6(P＜0.05);S3 V S S4,S5,S6(P＜0.05)。

组别 BcL-2 Bax Caspase-3 Tunel Bcl-2/Bax S1再灌注 1h 11.17± 0.84 30.44± 0.51 30.47± 0.51 36.34± 0.52 0.37 S2再灌注 6h 20.49± 0.60 36.47± 0.44 36.42± 0.62 40.59± 0.49 0.56 S3再灌注 12h 25.79± 0.69 43.21± 0.47 40.48± 0.55 45.57± 0.53 0.60 S4再灌注 24h 33.25± 0.52 50.40± 0.64 46.57± 0.58 53.02± 0.79 0.66 S5再灌注 48h 39.00± 0.91 55.48± 0.93 51.43± 0.87 59.32± 0.57 0.70 S6再灌注 72h 35.24± 0.53 53.21± 0.46 43.74± 0.80 54.57± 1.04 0.66 E1再灌注 1h 15.32± 0.37 25.36± 0.53 28.44± 0.48 33.22± 0.46 0.60 E2再灌注 6h 25.32± 0.41 20.27± 0.41 23.32± 0.84 29.21± 0.57 1.25 E3再灌注 12h 30.77± 0.37 18.00± 0.67 19.96± 0.17 26.63± 0.57 1.71 E4再灌注 24h 39.62± 0.53 15.44± 0.48 17.47± 0.52 22.24± 0.54 2.57 E5再灌注 48h 45.89± 0.77 13.36± 0.55 14.23± 0.44 18.09± 0.46 3.43 E6再灌注 72h 40.26± 0.46 10.32± 0.57 10.36± 0.51 12.63± 0.46 3.90 F 30.18 31.00 30.24 36.03 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

3 讨论

由于大鼠的脑血管分布非常类似人脑,我们以 Wistar大鼠为研究对象,通过电凝和血管夹阻断大鼠的供应大脑的四条大血管建立起来全脑缺血再灌注模型,于类似全脑缺血再灌注的疾病如心肺复苏,器官移植、溶栓术、冠脉搭桥术、低血压休克等回复灌流后所引起的病理生理过程,缺血是肯定,符合临床实际。细胞凋亡的概念是由英国病理学家 Kerr等[3]在1972年提出来用于描述一种在形态学有别于细胞坏死的过程。细胞凋亡是细胞在基因的调控下主动性程序性死亡,受促进凋亡基因和抑制凋亡基因的协调及双重调控。Bax是 Bcl-2家族成员之一。Caspase酶是一种半胱氨酸蛋白激酶,与凋亡启动和效应阶段密切相关,Caspase-3是促凋亡信号转导通路的关键效应酶,又称杀手蛋白[4];Caspase-9和Caspase-8分别启动的细胞内 /外促凋亡通路都与 Caspase-3。近年来在研究缺血再灌注损伤中发现,活化的 Caspase-3可以降解 BcL-2,促使线粒体释放 Cyto C,进而引起细胞的破坏[5],运用 Caspase-3抑制剂可以改善在缺血再灌注损伤中细胞的损伤和破坏,提示抑制 Caspase酶的活性可以防止缺血再灌注损伤中细胞的凋亡的关键环节[6]。在被实验中,Bcl-2在 S组和 E组均在回复灌注 48h到达高峰 ,而在 E组中,Bcl-2再灌注的时间增加,表达也逐渐升高,且一直高于S组 Bcl-2蛋白表达。Bax和 Caspase-3也都在回复灌注48h蛋白表达到达高峰,随后降低 ,而在 E组 Bax和 Caspase-3表达降低。TUN EL在 S组中,48h凋亡达到在高峰 ,伴随再灌注时间的延长,凋亡之间减少;在 E组,凋亡细胞一直在穗再灌注时间的增加而缓慢减少。依托咪酯系一种催眠性静脉全麻药 ,是咪唑类衍生物,安全性大,对呼吸和循环影响小,是麻醉诱导常用的药物之一。综上所述,在大鼠全脑缺血再灌注损伤过程中,依托咪酯可以促进大鼠海马抗凋亡基因Bch-2的表达,进而促进 Bch-2蛋白表达,同时减少 Bax和Caspase-3蛋白表达。依托咪酯能在缺血再灌注的组织器官中减少细胞的凋亡,具体的相互关系有待进一步的研究。

参考文献:

[1]Pulsinelli WA,JamesBA.New model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat[J].Stroke,1979,10:267

[2]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20:84-91

[3]Kerr JF,Wyllie AH.Currie AR.Apoptosis:a basic biological phenomenon with Wide-ranging implication in tissure kinetics[J].Br J Cancer,1972,26(4):239-257

[4]Hung T,LV G,SUN j,et al.expression and signifience of PTEN and caspase- 3 inostesarcoma[J].China Journalofmodem Medicine,2005,15(2):168-171

[5]Kirsch DG,Doseff A,Chau BN,et al.caspase-3dependent clevage of Bcl-2 promotes release of cytochrome C[J].J Bioichem,1999,274:21155-21161

[6]Grunenfelder J,Miniation,Murata S,et al.Upregulation of Bcl-2 through caspase-3 inhibition ameliorate ischemia/reperfusion injury in rats cardiac allograft[J].Circulation,2001,104:202-206