A β25～35寡聚体对原代培养海马神经元突触的损伤作用

胡旭慧,黄昕艳,朱晓峰

(佳木斯大学神经科学研究所,黑龙江 佳木斯 154007)

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一种以进行性认知功能减退为特征的神经变性疾病。典型的病理学改变为:老年斑、神经原纤维缠结、神经元突触功能异常。AD的病因复杂,AD是多种因素共同参与的结果,其中老年斑的主要成分β-淀粉样蛋白(Amyloid-β,A β)被认为是该病发病机制中的起始因素和关键环节,尤其是可溶性 A β寡聚体的神经毒性作用日益被重视,突触功能障碍及缺失是与认知功能下降关系最为密切的病理变化。突触可塑性被认为是学习和记忆的生理基础,与生长相关蛋白43(growth-associated protein43,GAP-43)的表达相关,国际上将 GAP-43列为研究神经生长发育和损伤修复等神经可塑性的首选分子探针。本研究用 A β25～35寡聚体作用于原代培养的海马神经元 ,观察寡聚体 A β25～35对 GAP-43表达的影响 ,以期对 AD早期的发病机制有进一步的认识。

1 材料与方法

1.1 材料

B27添加剂、DM EM/F12、胎牛血清购自 GIBCO,GAP-43及 A β25～35均购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 海马神经元的原代培养

选用出生1d内的 Wistar大鼠,解剖分离出海马,经0.125%胰酶消化8～12min,用含有10%胎牛血清的DM EM/F12种植液终止消化。经悬浮、离心、过滤等步骤收集细胞,用种植液制成密度为 5× 105个 /mL的单细胞悬液 ,接种于预先铺有多聚赖氨酸的24孔培养板内,置于37℃,5%CO2培养箱中培养。24h后换含 2%B27的 DMEM/F12培养基。每隔3d半量换液1次。

1.2.2 实验分组及 A β25～35寡聚体干预

海马神经元培养7d后,弃原培养液。加入 DMEM培养液及 A β25～35寡聚体 ,A β25～35寡聚体的制备参考王建秀等文献[1,2]。实验分为三组 ,使 A β25～35寡聚体的终浓度分别为 0.2、1、5umol/L,同时设不加 A β25～35寡聚体的对照组。每组设 8孔。1h后终止培养,以 GAP-43为一抗,进行免疫细胞化学染色。

1.3 统计学处理

2 结果

A β不同浓度组对 GAP-43表达的影响,见表1。

表1 A β25～35寡聚体不同浓度组对 GAP-43表达的影响 (± s,n=8)

表1 A β25～35寡聚体不同浓度组对 GAP-43表达的影响 (± s,n=8)

与正常对照组比较# P＞ 0.05,△P＜ 0.05,*P＜ 0.01,1umol/L组与5umol/L组比较,P ＜0.01。

组 别 平均灰度值正 常 对 照 组 238.65±0.26 0.2umol/L组 238.73± 0.24#1umol/L组 239.06± 0.22△5umol/L组 251.71± 0.26*

3 讨论

以往对 A β神经毒性研究集中于聚集态,近来研究表明,A β在形成纤维性沉积前的中间体状态即 A β寡聚体亦可产生神经毒性作用。AD早期,非纤维状、寡聚的 A β可在极低浓度即迅速引起突触功能紊乱[3],其神经毒性远强于其他不可溶性类淀粉样蛋白,而突触功能障碍及缺失是与认知功能下降关系最为密切的病理变化[4]。脑内突触结构和功能的可塑性已被证实是学习记忆的重要神经生物学机制,而可溶性A β寡聚体能够直接参与 AD中突触可塑性和记忆的损伤[5],故研究 A β寡聚体致伤与突触蛋白的改变对于阐明 AD的发病机制很有益处。GAP-43是神经组织特有的一种磷酸蛋白,具有高亲水性并可能通过与膜脂肪酸共价连接而与神经元膜结合,分布于突触前膜和生长锥上,特别是在生长、分化及再生的轴突末端含量最高。突触可塑性变化与 GAP-43的表达相关,首先突触形态结构变化可导致 GAP-43表达的变化。其次,由长时程增强和长时程抑制所引发的突触效能的变化,可影响 GAP-43的磷酸化状态和 mRNA的表达。有研究发现 GAP-43磷酸化程度与长时程增强的表达呈正相关。因此,GAP-43可作为研究与认知相关的脑区发生突触可塑性改变的重要标志。本研究结果表明 ,A β25～35寡聚体能低 GAP-43的表达,呈剂量依赖性,5umol/L A β的致伤作用非常显著。可以推测,在此浓度作用下轴突生长基本停止,递质释放受到抑制,突触后信号转导和整合出现障碍,突触可塑性严重受损。随着对 A β寡聚体、突触可塑性机制的深入的研究与了解,可进一步揭示 AD的发病机制,将会促进靶向 A β寡聚体的药物的开发和临床应用,可能会在神经变性之前阻断 A β寡聚体对突触的损害,重新建立神经突触,为AD的早期干预、治疗以及新药物的研发开拓了新的思路与方向。

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