芦丁促进大鼠泌乳性能的研究

郭旭东 刁其玉* 王月影 屠 焰 闫贵龙 汪新建邓凯东 张乃锋 鞠翠芳 李军涛 宋 凯 顾小卫

(1.中国农业科学院饲料研究所,农业部饲料生物技术重点实验室,北京 100081;2.河南农业大学,农业部动物生长发育调控重点开放实验,郑州 450002;3.河北北方学院,张家口 075000;4.扬州大学,扬州 225009)

芦丁促进大鼠泌乳性能的研究

郭旭东1刁其玉1*王月影2屠 焰1闫贵龙3汪新建2邓凯东1张乃锋1鞠翠芳1李军涛2宋 凯2顾小卫4

(1.中国农业科学院饲料研究所,农业部饲料生物技术重点实验室,北京 100081;2.河南农业大学,农业部动物生长发育调控重点开放实验,郑州 450002;3.河北北方学院,张家口 075000;4.扬州大学,扬州 225009)

通过研究天然植物提取物芦丁对大鼠泌乳性能、内分泌激素、脏器指数的影响,考察芦丁调节大鼠泌乳的效果。试验选择18只Wistar受孕母鼠,随机分为3组,每组6只,分别为对照组、芦丁组(每日灌服芦丁60mg/kg BW)、雌二醇组(每周肌肉注射雌二醇60μg/kg BW),从哺乳第4天开始连续给药2周,基础饲粮相同。测定指标包括:大鼠泌乳量,仔鼠平均体增重,乳腺器官指数,胸腺指数,脾脏指数,血浆与乳腺组织中雌激素(E2)、孕激素(P)、催乳素(PRL)、生长激素(GH)的含量。试验结果显示:芦丁组大鼠泌乳量显著高于对照组(P＜0.05),与雌二醇组差异不显著(P＞0.05);仔鼠体增重芦丁组与雌二醇组差异不显著(P＞0.05),但显著大于对照组(P＜0.05);大鼠血浆与乳腺组织中E2、PRL、GH的水平,芦丁组显著高于对照组(P＜0.05),低于雌二醇组(P＜0.05),P水平各组间差异不显著(P＞0.05);大鼠乳腺、胸腺、脾脏器官指数雌二醇组显著高于芦丁组和对照组(P＜0.05)。由此得出,芦丁能够显著提高大鼠泌乳量,促进大鼠胸腺、脾脏等器官的发育。

芦丁;大鼠;泌乳;激素;器官指数

哺乳动物的母乳具有营养和免疫保护等功能,不仅能供给幼畜丰富的营养,更重要的是,它还向幼畜提供抵御外来病原微生物侵袭的能力,同时充足的乳汁还是保证新生动物生长发育、种群繁衍和繁殖成功的关键因素[1-2]。动物泌乳功能的发挥依赖于泌乳器官乳腺,而乳腺的发育与泌乳功能受多种激素与生长因子的调控,其中非常重要的一个激素就是雌激素(E2)[3],即使分娩之后泌乳功能已经启动,但乳腺的发育要延续到哺乳早期,因此在泌乳期内,动物的产奶量与母体的E2水平密切相关[4]。现有试验证实E2促进乳腺发育和泌乳效果的影响都是显著的[5]。芦丁(rutin)又名芸香苷,广泛存在于自然界中,是一种从植物中提取的黄酮类化合物,具有多方面的生物活性,价廉易得[6],是具有广阔开发前景的药用植物活性成分[7],既可以作为治疗药物,又可以作为保健品[8]。芦丁在结构上为由槲皮素C3位上的羟基和芸香糖结合而形成的双糖苷,如图1所示[9-11],该结构与内源性雌激素17-β-雌二醇(17-β-E2)以及合成品己烯雌酚(DES)具有相似的平面双苯环结构。通常认为,这种结构,可以通过结合于17-β-E2所占据的雌激素受体(ERs)的相同位点而发挥弱E2作用[12-14]。因此研究芦丁对泌乳神经内分泌的影响,对乳腺发育和泌乳的作用,对类植物雌激素作用效果具有重要的意义。已有研究表明芦丁具有维生素P样作用[8]、抗自由基作用、抗脂质过氧化作用、舒张血管作用、抗病毒作用、拮抗血小板活化因子作用、抗急性胰腺炎作用、对胃溃疡的保护作用等[7]。与芦丁结构相似的大豆黄酮、葛根、黄芪、芒丙花素、淫羊藿等植物雌激素类物质能够对动物机体的内分泌产生影响,促进动物泌乳[15-19]。但是,有关芦丁的类E2作用研究还比较少见,其特殊的结构,是否能在机体内起到一定的E2作用亟需探讨。本试验以W istar泌乳大鼠为研究对象,通过研究灌服芦丁对大鼠泌乳量、脏器指数、血浆与乳腺组织中E2、孕激素(P)、催乳素(PRL)、生长激素(GH)的水平和仔鼠体重等的影响,探讨芦丁的类E2作用和促进泌乳的效果,为芦丁在泌乳生理上更广泛的应用提供数据参考和依据。

图1 芦丁的结构Fig.1 Structure of rutin

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点

本试验于2009年12月—2010年2月,在农业部动物生长发育调控重点开放实验室和河南农业大学生理生化实验室进行。

1.2 试验材料及动物

芦丁:从槐花米中提取,购自山西云鹏制药有限公司;雌二醇:苯甲酸雌二醇注射液,购自上海通用药业有限公司。

普通级W istar大鼠,购自河南省实验动物中心,其中雌鼠30只,体重200～250 g,雄鼠15只,体重250～300 g。在12 h光照和12 h黑暗的条件下进行喂养,环境温度为15～20℃,相对湿度50%～70%,自由采食和饮水。大鼠基础饲粮的组成及营养水平见表1。

1.3 试验设计

W istar大鼠按照雌雄2︰1的比例进行配种,分娩后选择分娩时间接近的18窝进行试验,分为对照组、芦丁组、雌二醇组,每组6窝,每窝留取6只仔鼠,用于泌乳试验。以分娩当日为第0天,为减少分娩对大鼠造成的应激和体质下降的因素对试验结果的影响[20],试验从第4天开始灌服和记录泌乳量,至第16天结束,灌服每天进行,泌乳量隔日记录,共记录7次。

对照组每日每头灌服2 m L生理盐水1次;芦丁组每日灌服芦丁1次(60 mg/kg BW);雌二醇组每周肌肉注射雌二醇1次(60μg/kg BW)。

1.4 样品采集与处理

1.4.1 血浆样品的采集与处理

在第7次记录泌乳量后,按照10 m L/kg BW的剂量腹腔注射10%的水合氯醛麻醉,然后心脏取血5m L左右,于加有抗凝剂的真空采血管中,采血后离心(4 000 r/m in,15 m in)取血浆,分别装于2支有盖离心管中,于-20℃冰箱中保存,待测。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Com position and nutritient levels of basal diet(air-dry basis) %

1.4.2 乳腺组织、胸腺、脾脏样品的采集与处理

大鼠取血后处死,迅速取腹部近尾端3对乳腺中右侧的乳腺组织于液氮中速冻,然后置于-80℃冰箱中保存,待测;同时迅速取腹部近尾端3对乳腺中左侧的乳腺组织、胸腺、脾脏,用吸水纸去除明显附留的液体,迅速称重;并取大鼠蹊部乳腺组织,用10%中性甲醛固定,用于组织切片制作。

1.4.3 乳腺组织匀浆液的制备

取大小适宜的已冷冻的大鼠乳腺组织,在冰生理盐水中漂洗,去除血液,滤纸擦干,称重,放入5～10 m L烧杯内,用移液管量取预冷的匀浆介质(生理盐水),体积总量是组织块重量的9倍,用组织捣碎机上下研磨制成10%的组织匀浆液,将制备好的10%的匀浆液4℃、2 000 r/m in离心15 min,取上清液于-20℃的冰箱中保存,待测。

1.5 测定指标及方法

1.5.1 大鼠泌乳量

参考袁淑德等[21]、Sheffields[22]、张荣庆等[15]、王艳玲等[23]、汤永玖等[24]、曹香林等[16]等方法,并略有改进。具体方法如下:将每只泌乳大鼠及其哺育的仔鼠作为一个观察单位记录,当天08:00起将仔鼠与泌乳大鼠分离,4 h后将仔鼠放回泌乳大鼠身边,哺乳1 h,用天平分别称取每窝大鼠哺乳前后的体重,其差值为该泌乳大鼠在此间的泌乳量。哺乳期间禁食禁水,从第4天至第16天共记录7次。

1.5.2 仔鼠平均体增重

在测定大鼠泌乳量的同时,称取每窝仔鼠哺乳前的体重,由每窝仔鼠的重量求得当日该窝仔鼠的平均体重,即为仔鼠体重[15-16,21-24]。将每次仔鼠体重(第1次记录除外)减去第1次记录的仔鼠体重,得到仔鼠体增重。

1.5.3 大鼠器官指数

大鼠器官指数(mg/g)=大鼠器官组织重(mg)∕体重(g)。

在本试验中大鼠乳腺组织重指大鼠腹部近尾端3对乳腺中左侧的乳腺组织重。

1.5.4 乳腺组织匀浆液中蛋白质含量的测定

用美国Thermo公司生产的微量分光光度计测定乳腺组织匀浆液中蛋白质的含量,用于计算组织蛋白中激素的含量。

1.5.5 激素含量

大鼠血浆与乳腺组织中 E2、P、PRL、GH 的测定采样放射性免疫方法。试剂盒均为北京科美东雅生物技术有限公司生产,按试剂盒说明书要求操作。用γ-计数器测定沉淀每分钟脉冲数(cpm),通过标准曲线换算血浆和乳腺组织匀浆液中激素的含量,根据乳腺组织匀浆液中蛋白质浓度及放射免疫所测乳腺组织匀浆液中的激素含量,将样品中激素的量换算成单位组织蛋白中激素的含量。

1.6 主要仪器

SN-659型智能放免γ测量仪(上海应用物理所日环光电仪器有限公司);高速组织匀浆机(德国IKA);微量分光光度计(美国Thermo);高速冷冻离心机(美国Sigma);-80℃冰箱;-20℃冰箱;电子天平等。

1.7 数据统计分析

试验数据采用SAS 8.2统计软件ANOVA进程进行分析,差异显著则采用Duncan氏法进行多重比较,数据用平均值±标准误表示,显著水平为P＜0.05。

2 结 果

2.1 泌乳大鼠平均泌乳量的变化

由表2可见,各组大鼠在初期泌乳量相差不大,随着仔鼠日龄的增加,泌乳大鼠在1 h内的泌乳量都呈现上升趋势。在泌乳的第4天和第6天,3组大鼠泌乳量差异不显著(P＞0.05)。在第8天时,雌二醇组显著高于对照组(P＜0.05),芦丁组与对照组和雌二醇组差异不显著(P＞0.05)。在第10～14天,雌二醇组显著高于芦丁组和对照组(P＜0.05)。在第16天,芦丁组与雌二醇组差异不显著(P＞0.05),雌二醇组和芦丁组都显著高于对照组(P＜0.05)。试验全程大鼠泌乳量芦丁组显著高于对照组(P＜0.05),与雌二醇组差异不显著(P＞0.05)。

表2 大鼠泌乳量Tab le 2 Milk yield of rats(n=6) g/h

2.2 仔鼠平均体增重

由表3可见,各组仔鼠平均体增重都随日龄的增加而增长。在试验第6、8天时,3组间差异不显著(P＞0.05)。从第10天开始至第16天观察结束,雌二醇组和芦丁组均显著高于对照组(P＜0.05)。

表3 仔鼠体增重Table 3 The body w eight gain of filial rats(n=36) g/只

2.3 大鼠器官指数

2.3.1 乳腺器官指数

乳腺器官指数数据见表4,数据显示3组间差异显著(P＜0.05),数值由小到大的顺序为对照组、芦丁组、雌二醇组。

表4 大鼠乳腺器官指数Table 4 Mammary gland index of rats(n=6)%

2.3.2 免疫器官指数

免疫器官指数数据见表5,对照组、芦丁组、雌二醇组 3组间胸腺指数和脾脏指数均差异显著(P＜0.05)。

表5 大鼠免疫器官指数Table 5 Immune organ indices of rats(n=6)%

2.4 血浆和乳腺组织中E2、P、PRL、GH的水平

试验结果见表6。E2、PRL、GH在血浆与乳腺组织中的水平都呈现对照组、芦丁组、雌二醇组数值依次增大的趋势(P＜0.05)。P在血浆与乳腺组织中的水平组间差异均不显著(P＞0.05)。

表6 大鼠血浆与乳腺组织中 E2、P、PRL、GH 的水平Table 6 The levels of E2,P,PRL and GH in p lasm a andm ammary gland tissues(n=6)

3 讨 论

3.1 芦丁对大鼠泌乳性能的影响

本试验关于芦丁对大鼠泌乳的影响结果显示,从泌乳第4天至第16天,由组间差异不显著(P＞0.05),到雌二醇组高于芦丁组高于对照组(P＜0.05),至试验后期雌二醇组和芦丁组高于对照组(P＜0.05)。在整个试验期内大鼠平均泌乳量芦丁组(7.35 g/h)比对照组(5.73 g/h),提高了26.94%(P＜0.05),表明芦丁能够显著提高大鼠的泌乳量。这与典型的植物雌激素异黄酮等的作用类似。张荣庆等[15]报道大豆黄酮显著提高正常大鼠的泌乳功能;曹香林等[16]报道,富含植物雌激素的中草药葛根、黄芪能够显著增加大鼠泌乳量;刘根桃等[17]报道,大豆黄酮能够提高母猪泌乳量;郝振荣等[4]报道,大豆黄酮能够提供奶牛产奶量。

哺乳仔鼠的体增重能够间接反映母鼠泌乳量的变化[23]。研究发现,由于哺乳仔鼠摄入能量的唯一途径是吸吮母鼠乳汁,因此,哺乳仔鼠的体增重与母鼠的乳汁量关系密切,是反映大鼠乳汁分泌量的客观指标[25-26]。已有研究表明,大豆黄酮、葛根、黄芪等能够显著提高大鼠仔鼠平均体重[15-16]。本试验中,泌乳初期各组仔鼠的体增重基本一致,随着日龄的增加,体重都在快速增长,但雌二醇组和芦丁组增长的速度明显大于对照组,其仔鼠的体增重在中后期显著地高于对照组(P＜0.05)。本试验中芦丁能够显著提高仔鼠的平均体增重,其效果接近雌二醇组,提示芦丁具有较强的催乳作用,能够显著提高大鼠泌乳性能,这与何俏军等[27]的研究结果一致。

乳腺器官指数,能够从侧面反映大鼠乳腺发育与泌乳功能情况。在本试验中,各组大鼠乳腺器官指数的数值由小到大的顺序为:对照组、芦丁组、雌二醇组,提示芦丁能够促进乳腺的发育。上述结果与张荣庆等[15]报道的大豆黄酮能够显著提高泌乳大鼠乳腺重量,王伟群等[18]报道的芒丙花素能够显著增加小鼠乳腺相对重量相一致。

本试验中大鼠泌乳量、仔鼠体增重变化、大鼠乳腺器官指数的试验结果都表明,芦丁具有类E2作用效果,能够提高大鼠泌乳性能。

3.2 芦丁对大鼠免疫器官的影响

动物的脏器重量与脏器指数是生物医学研究的重要基础指标[28-29],是临床医学和科学研究的重要依据,它不仅对动物生理状态和饲养管理具有指导意义,而且是病理学、毒理学研究与探讨发病机理等研究中动物选择的依据[30]。测定脏器重量与其指数不仅能够反映脏器本身的结构改变,同时还可以反映生理性功能状态,如免疫功能、生殖功能等[31-32]。脾脏与胸腺是动物体内重要的免疫器官,与体液免疫和细胞免疫均有密切关系,它们对细胞免疫、体液免疫以及巨噬细胞的吞噬功能等免疫功能发挥重要的作用[33]。免疫器官重量与指数在一定程度上可以反映免疫器官内淋巴细胞和巨噬细胞等免疫活性细胞的数量,可作为辅助性的免疫检测手段,用来了解体内淋巴细胞总体水平[34]。本试验研究结果显示,大鼠胸腺指数芦丁组显著高于对照组(P＜0.05),脾脏指数芦丁组显著高于对照组(P＜0.05),表明芦丁能够显著促进大鼠胸腺和脾脏器官的发育,这对于增强大鼠机体免疫机能有积极意义。

3.3 芦丁对大鼠内分泌的影响

本试验结果显示,泌乳大鼠血浆中E2、PRL、GH的水平组间差异显著(P＜0.05),数值由对照组、芦丁组、雌二醇组依次增高。在乳腺组织中E2、PRL、GH的水平由低到高的顺序也是对照组、芦丁组、雌二醇组,组间差异显著(P＜0.05),3种激素在大鼠血浆与乳腺组织中呈现相同的规律。血浆与乳腺组织中P含量组间差异不显著(P＞0.05)。这与张荣庆等[15]报道的大豆黄酮能够显著地提高大鼠血液中GH、PRL的水平,王伟群等[25]报道的芒丙花素能够显著提高小鼠血浆 PRL水平,曹香林等[16]报道的葛根、黄芪能够显著提高大鼠外周血液中GH和PRL的水平,于燕等[19]报道的淫羊藿可明显提高小鼠血清E2水平,姜晶晶等[35]报道的植物雌激素亚麻籽木脂素显著提高大鼠血清中E2水平的结论相似。

本试验关于芦丁对大鼠泌乳内分泌激素影响的结果表明,芦丁与内源性雌激素作用有相似或接近的效果,但其强度较为缓和,表现出微弱的E2活性。芦丁化学名称为5,7,3',4'-四羟基-3-芸香糖黄酮,分子式为C27H30O16◦3H2O,相对分子量为610.5[36-37],它及其代谢产物苷元槲皮素都具有与内源性雌激素相似的平面双苯环结构,并符合植物雌激素的结构特点[14,38-39]。研究表明,芦丁及其槲皮素在肠道经位于细胞顶膜的多抗药性相关蛋白2(MRP2)的载体作用,通过肠上皮细胞进入动物机体内[40-41]。被吸收进入机体的芦丁及其代谢产物槲皮素,由于结构的特点,能够与ER结合,进而表现出类E2作用。已有研究证实,植物雌激素调节动物机体内分泌,进而影响泌乳功能的作用机制主要为:1)直接作用于乳腺的ER,表现雄激素样生物效应[42];2)可作用于下丘脑、垂体、促进GH和PRL分泌,通过增加内源性的GH和PRL水平来促进乳腺发育和泌乳[16]。GH能够调节物质代谢和营养成分在组织间的分配,以保持乳腺摄取丰富的营养[43];能够刺激肝脏等其他器官产生胰岛素样生长因子(IGF-1),作用于乳腺细胞的IGF-1受体促进乳腺发育和泌乳[44],同时IGF-1作用于乳腺细胞后,能够增加乳腺血流量,并刺激乳腺的上皮细胞分化成乳腺细胞,促使乳汁分泌增加[4]。PRL能够作用于乳腺的PRL受体和诱导肝脏等器官产生PRL协同因子发挥作用[45];3)能够影响动物神经内分泌系统的下丘脑-垂体-性腺轴,增加乳腺细胞、垂体、下丘脑的ERs的数目和亲和力[46];4)能够增加乳腺细胞孕激素受体(PR)的数目和亲和力[42]。芦丁作为植物E2类似物,其通过对大鼠内分泌激素的影响进而调节大鼠泌乳的作用机制与上述作用类似。

4 结 论

①本试验每日灌服芦丁60mg/kg BW能够显著提高大鼠泌乳量,提高仔鼠体增重,提高乳腺器官指数,提高血浆与乳腺组织中 E2、PRL、GH 的水平。

②本试验每日灌服芦丁60mg/kg BW能够促进大鼠免疫器官胸腺、脾脏发育。

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*Correspond ing au thor,p rofessor,E-m ail:d iaoqiyu@mail.caas.net.cn

(编辑 武海龙)

Rutin Prom otes Lactation of Rats

GUO Xudong1DIAO Qiyu1*WANG Yueying2TU Yang1YAN Guilong3WANG X ing jian2DENG Kaidong1ZHANG Naifeng1JU Cuifang1LIJuntao2SONG Kai2GU Xiaowei4

(1.Key Labora tory of Feed Biotechnology of Ministry of Agriculture,Feed Research Institu te,Chinese Academy of Agricultu ral
Scien ces,Beijing100081,Ch ina;2.Key Laboratory of AnimalGrow th and Development Ministry of Agriculture,
Henan Agricultural University,Zhengzhou450002,China;3.Hebei North University,Zhangjiakou075000,China;4.Yangzhou University,Yangzhou225009,China)

The objective of this study was to investigate the regulatory effect of rutin on lactation of rats by exam ining the effects of a natural p lantextract rutin onm ilk yield,endocrine horm ones and organ indices of rats.Eighteen p regnantW istar rats were random ly assigned to 3 treatments:contro l,gastric in fusion of rutin at 60mg/kg BW per day,and intramuscular in jection of estradiol 60μg/kg BW w eek ly from the fourth lactation day for tw o weeks with the same basal diet.The m ilk yield of rats,body w eightgain of filial rats,mammary gland index,thymus index,sp leen index,the levels of estrogen(E2),progesterone(P),prolactin(PRL)and growth horm one(GH)in plasma and gland tissuesweremeasured.Them ilk yield of the rats receiving rutin was higher than that of the control group(P＜0.05),but lower than that of the estradio l group(P＞0.05).The body w eight gain of the p rogeny from the rats receiving rutin w as higher than that of the contro l group(P＜0.05),but lower than that of the estradiol group(P＞0.05).The levels of E2,PRL and GH in p lasma and gland tissues of the rats receiving rutin w as higher than that of the controlgroup(P＜0.05),but less than that of the estradiol group(P＜0.05),and the dif ferences of P levelamong groups were not distinct(P＞0.05).The indexes ofmammary gland,thym us and spleen of the rats receiving estradio lwere higher than those receiving rutin or the control group(P＜0.05).In conclusion,dietary rutin significantly improves them ilk yield and accelerates growth of the thymus and spleen of rats.[Chinese Journalof Animal Nutrition,2010,22(6):1775-1782]

rutin;rats;lactation;hormone;organ indices

S816.15

A

1006-267X(2010)06-1775-08

10.3969/j.issn.1006-267x.2010.06.045

2010-06-08

国家“十一五”科技支撑计划《农副产品饲料转化与高效利用关键技术研究》(2006BAD 12B04-04)

郭旭东,男,贵州贵阳人,博士研究生,主要从事动物生理与营养研究。E-mail:gxd.168@163.com

*通讯作者:刁其玉,研究员,博士生导师,E-mail:diaoqiyu@m ail.caas.net.cn