饲粮硒来源及添加水平对仔猪组织中细胞内谷胱甘肽过氧化物酶基因mRNA表达的影响

王秀娜 耿忠诚* 王 燕 刘胜军 武志敏

(1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院,大庆 163319;2.东北农业大学动物科技学院,哈尔滨 150030)

饲粮硒来源及添加水平对仔猪组织中细胞内谷胱甘肽过氧化物酶基因mRNA表达的影响

王秀娜1耿忠诚1*王 燕2刘胜军1武志敏1

(1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院,大庆 163319;2.东北农业大学动物科技学院,哈尔滨 150030)

本文旨在研究饲粮中硒来源及添加水平对仔猪细胞内谷胱甘肽过氧化物酶(GPX 1)m RNA表达的影响,为合理利用各种硒源提供一定的理论基础。选择35日龄体重相近的三江白猪仔猪90头,随机分为10组,每组3个重复,每个重复3头猪。分别在9个试验组饲粮中添加纳米硒、酵母硒、亚硒酸钠,其剂量以硒计,添加量分别为0.1、0.3、0.5m g/kg 3个水平,对照组饲粮中不另添加硒。试验期为35 d,试验结束后采用反转录RT-PCR技术测定仔猪肝脏、肾脏、脾脏、肌肉组织中GPX 1 m RNA的表达量。结果表明:1)在肝脏组织中,0.5 mg/kg纳米硒组GPX 1m RNA表达量显著高于亚硒酸钠组(P＜0.05),0.5mg/kg纳米硒组和0.3 mg/kg酵母硒组显著高于对照组(P＜0.05);2)在肾脏组织中,各试验组之间GPX1 m RNA表达量差异均不显著(P＞0.05);3)在脾脏组织中,0.5 mg/kg纳米硒组GPX 1m RNA表达量显著高于酵母硒组和亚硒酸钠组(P＜0.05),0.5 mg/kg纳米硒组和0.3 mg/kg酵母硒组显著高于对照组(P＜0.05);4)在肌肉组织中,0.5mg/kg纳米硒组GPX 1m RNA表达量显著低于亚硒酸钠组和对照组(P＜0.05)。由此可见,在饲粮中添加0.5 mg/kg纳米硒能够提高仔猪肝脏、脾脏中GPX 1m RNA的表达量,而肌肉组织中的表达水平则低于亚硒酸钠组和对照组。

硒;GPX 1;mRNA

硒是动物机体必需的微量元素之一,与抗氧化密切相关。硒依赖性的谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)是硒发挥抗氧化功能的主要形式,能清除组织中有害的过氧化物,保护生物膜和生物大分子免受氧化损伤[1]。GPX家族主要包括细胞内谷胱甘肽过氧化物酶(GPX 1)、胃肠谷胱甘肽过氧化物酶(GPX 2)、血浆谷胱甘肽过氧化物酶(GPX 3)等。其中GPX 1被证明是机体抗氧化的主要含硒蛋白[2],其活性水平常被用于测定人与动物的硒需要量。饲粮中硒水平与GPX 1活性和GPX 1 m RNA调控有关[3]。高剂量(0.50 mg/kg)纳米硒作为硒源调控肉鸡肝脏组织GPX 1m RNA稳定性的能力更强[4],硒蛋白基因在甲状腺和脑垂体中的表达不受硒不足或过量的影响[5],这说明硒蛋白在组织中的表达具有特异性[6]。在生产中为了满足仔猪健康生长对硒的需要量,在饲粮中通常添加一定量的外源性硒。目前主要以注射剂、粉剂及口服液形式应用亚硒酸钠进行补硒,但使用中存在吸收率低、过氧化作用以及有潜在污染等问题[7]。酵母硒是硒富集在生长酵母的细胞蛋白质结构内生产的有机硒。纳米硒是以蛋白质为核,红色元素硒为膜,蛋白质为分散剂的纳米粒子,尺寸为20～60 nm。具有较高的生物活性、安全性、抗氧化性和较高的吸收率等特点,在动物生产中有广泛的应用前景[8]。本试验在仔猪饲粮中分别添加纳米硒、酵母硒、亚硒酸钠,研究不同硒源及添加水平对仔猪不同组织中GPX 1 m RNA表达量的影响,为合理利用各种硒源提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物与饲养管理

选择35日龄体重相近的三江白仔猪90头,随机分为10组,每组3个重复,每个重复3头猪。分别在9个试验组饲粮中添加纳米硒、酵母硒、亚硒酸钠,各硒源同配合料倍比稀释,逐级放大混匀。其剂量以硒计,添加量分别为0.1、0.3、0.5 mg/kg 3个水平,对照组饲粮中不另添加硒。饲粮以玉米、豆粕为主,参照NRC(1998)标准及中华人民共和国农业行业标准NY/T 65—2004《猪饲养标准》,配合而成粉状饲料,饲粮组成及营养水平见表1。

表1 试验饲粮组成及营养水平(风干基础)Tab le 1 Com position and nutrient levels of the experim ental diet(air-d ry basis) %

1.2 样品采集

试验期为35 d,试验结束后,每个重复屠宰1头仔猪,取肝脏、肾脏、脾脏、肌肉组织样,迅速投入液氮中冷冻,-80℃保存。

1.3 GPX1基因mRNA表达丰度的测定

1.3.1 主要试剂

Trizol总RNA提取试剂盒(Invitrogen),反转录试剂盒(东洋纺科技),TaqDNA聚合酶(TaKa-Ra),dNTPMix(TaKaRa),DNA Marker DL 2000(TaKaRa)。

1.3.2 引物设计

根据GenBank中公布的猪GPX 1(NM 214201)和β-actin(U07786)的基因序列设计引物,GPX 1基因上游引物为 5′-CCCACGCTCGGTGTATGCCT-3′,下 游 引 物 为 5′-AGAAAGCGACGGCTGTACCTG-3′,β-actin 内参基因上游引物为 5′-CGGGACCTGACCGACTACCT-3′,下游引物为 5′-GGCCGTGACTCCTTCTGC-3′,引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。

1.3.3 总RNA提取

按Trizo l总RNA提取试剂盒试验操作步骤提取肝脏、肾脏、脾脏、肌肉组织中的总 RNA,用紫外分光光度计测定总RNA浓度,并在260和280 nm下测吸光度A值,计算OD260/OD280的值。此值在1.8～2.0时,表示提取的RNA纯度较高,适宜进行下一步试验。

1.3.4 cDNA的合成

根据反转录试剂盒步骤合成cDNA,具体过程如下:RNA 2 μg、Oligo(dT)1 μL,用 RNase Free H 2O补足到12μL,放入65℃水浴锅5m in,立即置于冰上2～3m in,继续向EP管中添加5×RTBuffer 4 μL、dNTP 2 μL、RNase Inhibitor 1 μL、Rever Tra Ace 1μL,然后依次42℃20m in、85℃5m in、4℃5m in,最后瞬间离心,于-20 ℃保存。

恩替卡韦联合水飞蓟素对乙型病毒性肝炎失代偿期肝硬化患者炎症指标及氧化应激水平的影响 ……… 李 珂等（1）： 98

1.3.5 PCR

GPX 1和 β-actin基因进行同管PCR,25μL反应体系为:10×PCR buffer 2.5μL,dNTP 2μL,βactin上游引物(10μm ol/L)0.5μL,β-actin下游引物(10μm)0.5μL,GPX 1上游引物(10μm)0.5μL,GPX 1下游引物(10μm)0.5μL,cDNA 1μL,Tap DNA聚合酶0.2μL,去离子水17.3μL。优化最佳退火温度和最佳循环数,确定PCR反应条件为:94℃预变性5m in,94℃变性30 s,63℃退火30 s,72℃延伸1 m in,31个循环,72℃延伸10 m in,4℃保存。

1.4 数据处理

电泳结束后,用全自动凝胶分析系统拍照,紫外分析系统(Gel-Pro IMAGER 60-2502CE)进行表达强度的分析,计算各基因条带的积分光密度(IOD),并以IOD(GPX 1)/IOD(β-actin)的值表示目的基因的相对表达量。试验数据用Excel整理,数据统计采用SAS 9.0软件包中的ANOVA程序进行方差分析,差异显著时采用Duncan氏方法对各组间平均数进行多重比较,以P＞0.05作为差异显著性判断标准。

2 结 果

2.1 RNA凝胶电泳检测结果

由图1可以看出,3条电泳条带(28S、18S和5S)清晰整齐,表明总RNA的提取效果较好,可以进行下一步试验。

图1 总RNA样本电泳结果Fig.1 Electrophoresis result of total RNA samp le

2.2 PCR产物电泳检测结果

由图2可以看出,530 bp GPX 1目的基因和411 bpβ-actin内参2条扩增片段条带清晰整齐,可以进行积分光密度分析。

图2 PCR产物电泳检测结果Fig.2 The electrophoresis test results of the PCR products

2.3 肝脏、肾脏、脾脏、肌肉组织中GPX1 mRNA的表达量比较

2.3.1 肝脏中GPX 1基因m RNA表达量比较

图3显示了不同硒源及添加水平对仔猪肝脏中GPX 1 mRNA表达的影响。由该图可知,对不同硒源而言,当以亚硒酸钠为硒源时,不同添加水平组之间GPX 1 m RNA表达量没有显著差异(P＞0.05);当以酵母硒为硒源时,0.3 mg/kg添加水平组的表达量显著高于对照组(P＜0.05);当以纳米硒为硒源时,0.5mg/kg添加水平组的表达量显著高于对照组(P＜0.05)。对不同添加水平而言,0.1和0.3mg/kg 2个添加水平下各个硒源组间 GPX 1 m RNA表达量差异均不显著(P＞0.05);在0.5mg/kg的添加水平下,纳米硒组GPX 1m RNA表达量显著高于亚硒酸钠组和对照组(P＜0.05)。

图3 不同硒源及添加水平对仔猪肝脏中GPX1 mRNA表达量的影响Fig.3 Ef fects of different selenium sources and leve ls on the expression level of GPX 1 m RNA in piglet liver

2.3.2 肾脏组织中GPX 1基因m RNA表达量比较

在肾脏组织中GPX 1基因mRNA表达量,由图4可以看出,各试验组之间以及试验组与对照组之间GPX 1 m RNA表达量差异均不显著(P＞0.05)。

2.3.3 脾脏组织中GPX 1基因m RNA表达量比较

脾脏组织中GPX 1基因m RNA表达量,由图5可以看出,对不同硒源而言,不同添加水平的亚硒酸钠组GPX 1 m RNA表达量之间没有显著差异(P＞0.05);酵母硒组0.3 m g/kg添加水平显著高于各试验组和对照组(P＜0.05);纳米硒组0.5 mg/kg添加水平组显著高于各试验组和对照组(P＜0.05)。对于不同添加水平而言,3种硒源间在0.1 mg/kg添加水平下GPX 1 mRNA表达量差异均不显著(P＞0.05);0.3m g/kg添加水平下,酵母硒组的GPX 1 m RNA表达量显著高于亚硒酸钠组(P＜0.05);0.5 m g/kg添加水平下,纳米硒组的GPX 1 m RNA表达量显著高于酵母硒组、亚硒酸钠组和对照组(P＜0.05)。3种硒源间表达量差异均不显著(P＞0.05);在0.5mg/kg添加水平下,纳米硒组GPX 1m RNA表达量显著低于亚硒酸钠组(P＜0.05),也显著低于对照组(P＜0.05)。

2.3.4 肌肉组织中GPX 1基因m RNA表达量比较

肌肉组织中GPX 1基因m RNA表达量,由图6可以看出,在0.1～0.3 mg/kg添加范围内,同一硒源的不同添加水平间差异均不显著(P＞0.05)。对不同硒源而言,在0.1和0.3m g/kg 2个添加水平,

图6 不同硒源及添加水平对仔猪肌肉中GPX1 mRNA表达量的影响Fig.6 Ef fects of different selenium sources and levels on the expression level of GPX 1 mRNA in pigletmuscle

3 讨 论

Lei等[9]和Kevin等[10]等研究了以亚硒酸钠为硒源,不同硒水平对大鼠肝脏GPX 1m RNA表达的影响,结果表明硒不影响GPX 1 m RNA的生成量,但影响m RNA的稳定性,大鼠体内硒缺乏时,GPX 1 mRNA稳定性降低,GPX 1 m RNA水平也随之降低。本试验结果显示,以亚硒酸钠为硒源时,不同添加水平的亚硒酸钠组之间GPX 1 m RNA表达量没有差异,这与上述研究结果一致。胥保华[4]研究发现,给鸡饲喂0.5 mg/kg水平的硒时,纳米硒组肝脏 GPX 1 m RNA丰度比亚硒酸钠组高31.25%(P＜0.05)。本试验结果表明,0.5 mg/kg纳米硒组的肝脏组织中GPX 1 m RNA表达量显著高于0.5 mg/kg亚硒酸钠组(P＜0.05)。这与胥保华研究结果一致。

肾脏是动物主要的排泄及分泌器官,也是机体中含硒量最高的器官,硒缺乏对肾脏影响极大。肾脏对硒代谢起重要作用,肾脏病变直接波及硒元素变化。各试验组肾脏组织GPX 1 m RNA表达量差异不显著,说明不同硒源以及0～0.5 mg/kg的不同添加水平并不影响肾脏组织中GPX 1 m RNA表达量。Zhou等[5]以猪为试验对象对GPX 1、硒蛋白W 1(SepW 1)、GPX 2等基因表达的研究表明,在垂体和甲状腺组织中这些基因的表达并不受硒不足或过量的影响,GPX 1 m RNA在肾脏中的表达可能具有和垂体、甲状腺组织表达类似的规律;这也可能和GPX 1在肾脏硒代谢中的重要性有关,GPX 1在肾脏组织中活性较高,硒能维持机体活化免疫应答,提高肾小球滤过率,减轻炎症发生。硒在肾脏组织中的重要性决定了其必有一套复杂的调控机制,所以饲料中硒的剂量高低并不能对GPX 1 m RNA表达造成影响。关于不同硒源和水平对猪肾脏组织GPX 1 m RNA表达量的影响还需进一步探讨。

脾脏是机体的重要免疫器官,而硒能促进淋巴细胞的增殖及动物免疫球蛋白的合成,提高免疫反应[11]。GPX 1 m RNA在脾脏中的表达特征类似于肝脏。笔者在以往的研究中发现仔猪血清免疫指标IgG、IgA、IgM、C3水平均以0.5 mg/kg纳米硒组最高,均显著高于对照组(P＜0.05),其中0.5 mg/kg纳米硒组的IgG、IgM、C3水平显著高于0.5mg/kg酵母硒组和亚硒酸钠组(P＜0.05)[12]。本试验发现,0.5 mg/kg纳米硒组脾脏中GPX 1m RNA表达量显著高于酵母硒组和亚硒酸钠组(P＜0.05),这一结果表明饲粮中添加0.5 mg/kg纳米硒可提高机体抗氧化能力,进而增强机体的免疫功能。

肌肉组织中,0.5 m g/kg纳米硒组的GPX 1 m RNA表达量显著低于0.5 mg/kg亚硒酸钠组和对照组肝脏组织中GPX 1m RNA的表达量。Peter等[6]报道,在大鼠各组织中进行硒蛋白m RNA表达量的研究,得出硒蛋白表达具有组织特异性。Evenson等[13]报道,在各种组织中GPX 1 m RNA表达明显不同,肝和脾GPX 1m RNA表达都比肌肉高。这可能是肌肉组织GPX 1 m RNA表达量与肝脏组织GPX 1m RNA表达量相反的原因,关于这方面的研究还少有报道,有待于进一步研究。

4 结 论

在饲粮中添加0.5 mg/kg的纳米硒可以提高仔猪肝脏、脾脏中GPX 1m RNA的表达量。

[1] REGINA B F.Tissue-specific functions of indixidual glutathione peroxidases[J].Free Radical Biology&Medicine,1999,27:951-965.

[2] CHENG W H,COMBS G F,LEI X G.Knockout of cellular glutathione peroxidase affects seleniumdependent param eters sim ilarly in m ice fed adequate and excessive dietary selenium[J].Biofactors,1998,7:311-321.

[3] 黄艳玲,吕林,张亿一,等.饲粮锰、锌、硒对动物基因表达的影响[J].动物营养学报,2007,19:475-480.

[4] 胥保华.纳米硒对Avian肉鸡的生物学效应及其分子机理研究[D].博士学位论文.杭州:浙江大学,2003:87-88.

[5] ZHOU JC,ZH AO H,LIJG,et al.Selenop rotein gene expression in thyroid and pituitary of young pigs is not affected by dietary selenium deficiency or excess[J].The Journalof Nutrition,2009,139(6):1061-1066.

[6] PETER R H,SIMONE C H,PING A L,et al.The selenoproteome exhibits w idely varying,tissuespecific dependence on selenoprotein P for selenium supply[J].Nucleic Acids Research,2007,3:1-11.

[7] MAHAN D C,PARRETT N A.Evaluating the e fficacy of selenium-enriched yeast and sodium selenite on tissue selenium retention and serum glutathione peroxidase activity in grower and finisher sw ine[J].Journal of Animal Sc ience,1996,74(12):2967-2974.

[8] 高建忠,黄克和.动物硒蛋白研究进展[J].畜牧与兽医,2004,36(7):39-42.

[9] LEI X G,JACQUELINE K E,KEV IN M,et al.G lutathione peroxidase and phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase are differentially regulated in rats by dietary selenium[J].The Journal of Nutrition,1995,125:1438-1446.

[10] KEVIN B H,ROGER A S.Selenium regulation of thioredoxin reductase activity and m RNA levels in rat liver[J].Journal of Nutritional Biochem istry,2001,12:693-702.

[11] COMBSG F,COMBSSB.The role of selenium in nutrition[M].New York:Academ ic Press,1986:78-81.

[12] 王秀娜,耿忠诚,武志敏,等.不同硒源对仔猪生长性能及体液免疫指标的影响[J].黑龙江八一农垦大学学报,2010,22(1):61-64.

[13] EVENSON JK,WHEELER A D,BLAKE SM,et al.Selenop rotein m RNA is exp ressed in b lood at levels comparable to major tissues in rats[J].The Journal of Nutrition,2004,134:2640-2645.

*Correspond ing au thor,p rofessor,E-m ail:gzcheng1950@163.com

(编辑 尚彬如)

Effects of Sources and Levels of Dietary Selenium on the Expression Levelof mRNA of Celluar Glutathione Peroxidase Gene in Piglets

WANG Xiuna1GENG Zhongcheng1*WANG Yan2LIU Shengjun1WU Zhim in1

(1.College of Animal Science and Technology,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing163319,China;2.College of Animal Science and Technology,Nor theast Agricultural Un iversity,Harbin150030,China)

This experiment was conducted to study the effects of sources and levels of dietary selenium on the expression level of mRNA of celluar glutathione peroxidase gene in pig lets,and to provide a theoretical basis for the rational app lication of various selenium sources.NinetySanjiangWhite piglets of 35 days old with sim ilar body weight were selec ted in the experiment.They were random ly divided into 10 groups with 3 replicates per group and 3 piglets per rep licate.Piglets in the 9 experim ental groups were fed nano-selenium,yeast selenium and sodium selenite at0.1,0.3 and 0.5 mg/kg(by selenium content),respec tively.No extra selenium w as added to the diet of the controlgroup.Theexperimental period was 35 days.RTPCR was used to determ ine the expression level ofm RNA of GPX 1 gene in the liver,kidney,spleen,andm uscle tissues of the piglets.The results showed as follows:1)in the liver tissue,the expression level of GPX 1 mRNA in nano-selenium group was significantly higher than that in sodium se lenite group at0.5m g/kg addition level(P＜0.05),and the expression level in 0.5 mg/kg nano-selenium group and 0.3mg/kg yeast selenium group was significantly higher than that in the control group(P＜0.05);2)in the kidney tissue,the dif ferences of the expression level of GPX 1m RNA in allexperimental groups were not significant(P＞0.05);3)in the sp leen tissue,the expression level of GPX1 mRNA in the nano-selenium group at 0.5 mg/kg w as significantly higher than that in the sodium selenite group and the yeast selenium group(P＜0.05),and the expression level in 0.5 mg/kg nano-selenium group and 0.3 mg/kg yeastselenium group w as significantly higher than that in the con trol group(P＜0.05);4)in the muscle tissue,the GPX 1 m RNA expression level in the nano-selenium group at 0.5 mg/kg w as significantly low er than that in the sodium selenite group and the control group(P＜0.05).It is concluded that dietary addition of 0.5 mg/kg nano-selenium can increase the expression level of GPX 1 m RNA in the liver and sp leen tissues of piglets,but in themuscle tissue,the expression level w as lower than that in the sodium selenite group and the controlgroup.[Chinese Journal of Animal Nutrition,2010,22(6):1630-1635]

selenium;GPX 1;m RNA

S828

A

1006-267X(2010)06-1630-06

10.3969/j.issn.1006-267x.2010.06.024

2010-05-13

黑龙江省农垦总局资助项目(HNKX IV-08-03-01);黑龙江省科技厅资助项目(PC 06S06)

王秀娜(1983—),女,黑龙江伊春人,硕士研究生,研究方向为单胃动物营养。E-mail:xiuna320@163.com

*通讯作者:耿忠诚,教授,硕士生导师,E-mail:gzcheng1950@163.com