仿生消化系统测定鸭饲料原料代谢能的重复性与精密度检验

李 辉 赵 峰 计 峰 张宏福*

(1.安徽农业大学动物科技学院,合肥 230036;2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,动物营养学国家重点实验室,北京 100193)

仿生消化系统测定鸭饲料原料代谢能的重复性与精密度检验

李 辉1,2赵 峰2计 峰1张宏福2*

(1.安徽农业大学动物科技学院,合肥 230036;2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,动物营养学国家重点实验室,北京 100193)

本试验通过采用仿生消化系统测定常用鸭饲料原料(玉米、豆粕、棉籽粕和小麦麸)干物质消化率与代谢能的变异,探讨该系统测定鸭饲料原料代谢能的重复性与精密度,为确立基于仿生消化系统定量测定饲料养分的生物学效价方法提供参考。重复性试验采用单因素完全随机设计,其中同一套仿生消化系统的重复性试验每一饲料原料设3个处理(批次),每个处理10个重复。不同套仿生消化系统间的重复性试验每一饲料原料设3个处理(仪器),每个处理10个重复。试验结束后分别测定每个重复的干物质消化率和代谢能。结果表明,同一套仿生消化系统不同批次间玉米、豆粕、棉籽粕和小麦麸干物质消化率与代谢能的批内变异系数、批间变异系数和总变异系数均小于1.40%,不同套仿生消化系统间玉米、豆粕、棉籽粕和小麦麸干物质消化率与代谢能的仪器内变异系数、仪器间变异系数和总变异系数均小于1.64%。通过对4种鸭饲料原料干物质消化率和代谢能进行正态性检验及95%置信区间分析,重复观测数据中玉米、豆粕、棉籽粕和小麦麸干物质消化率的最大绝对偏差分别控制在0.94%、1.00%、1.02%和0.88%以内,其中85%的观测数据最大绝对偏差均不高于0.75%;代谢能最大绝对偏差分别控制在0.18、0.29、0.18和0.24M J/kg,其中85%的观测数据最大绝对偏差均不高于0.22MJ/kg。从本试验的重复性及精密度看,采用该仿生消化系统测定鸭饲料原料代谢能可以达到较高的定量水平。

鸭饲料原料;代谢能;仿生消化系统;重复性;精密度

饲料的营养价值特别是可消化养分参数是优化饲料配方首先需要建立的基础数据。然而,传统生物学饲料养分的消化试验存在着耗资、费时、费力,系统误差大和重复性差等一系列问题,这已成为饲料营养价值评定工作中的重要技术瓶颈[1-2]。随着动物消化生理学、生物化学以及酶学等研究的深入,前人在通过模拟饲料养分在动物体内的酶水解规律的基础上提出了一些体外测试方法并取得了一些进展,但由于在测定酶活时不可避免地会受到来自手工测试环境的系统误差,从而导致这一技术路线受到质疑,特别是不同畜禽消化道内的酶谱变异规律不同,更导致了以酶法为主要手段的体外消化系统的设计与普及一直停滞不前[3-6]。然而通过体外模拟饲料养分在动物体内的消化程度以实现对饲料养分消化率的估测已逐渐被丹麦、荷兰、法国等发达国家所认同[7-8],但尚鲜见程控专门化的测试工具,重复测定的相对标准偏差仍然居高不下[9]。针对传统酶法的技术瓶颈问题,动物营养学国家重点实验室开发出了电脑程控自动模拟猪禽饲料养分消化的单胃动物仿生消化系统、标准酶试剂盒以及分离不消化物质的专用装置,由该装置测定的19个棉籽粕样品的鸭代谢能与排空强饲法测定的鸭代谢能较为接近[10]。由此可见,基于仿生消化系统的饲料养分生物学效价的评定方法有望成为一种快速、标准化方法。为了检验仿生消化系统能否达到饲料养分生物学效价定量测定的基本要求,本试验通过采用3套仿生消化系统分别测定不同批次间及不同套仿生消化系统间常用鸭饲料原料干物质消化率与代谢能的变异,探讨仿生消化系统测定鸭饲料养分生物学效价的重复性与精密度,为确立鸭饲料养分生物学效价的仿生评定方法提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用玉米(产地为北京)、豆粕(产地为河北)、棉籽粕(产地为山东)和小麦麸(产地为北京)4种常用鸭饲料原料为试验材料,采用四分法取样后用万能粉碎机粉碎并过40目筛,充分混合均匀,贮存于样品瓶中-20℃保存备用。4种饲料原料的营养水平见表1。

表1 4种饲料原料的营养水平(干物质基础)Tab le 1 Nutrient levels of 4 kinds of feedstuffs(DM basis) %

1.2 试验设计

采用单因素完全随机设计,同一套仿生消化系统的重复性试验每一饲料原料设3个处理(批次),每个处理10个重复。不同套仿生消化系统间的重复性试验每一饲料原料设3个处理(仪器),每个处理10个重复。

1.3 透析袋的处理与缓冲液的制备

将透析袋(MEMBRA-CEL MD 44-14,美国Viskase公司生产,截留分子量为14 000 u)剪成25 cm左右的小段,于质量浓度为2%NaHCO3和1mm ol/L EDTA(pH 8.0)混合溶液中煮沸10 min,然后用去离子水彻底清洗透析袋,再置于1mm ol/L EDTA(pH 8.0)溶液中煮沸 10 m in,冷却后4℃保存备用(确保透析袋始终浸泡在溶液内)。按照郑卫宽[10]的试验方法,在42℃下配制pH 2.0的盐酸溶液作为胃消化期的缓冲液,配制含青霉素、链霉素各 50万单位双抗的 0.2 mo l/L pH 6.5和7.9的磷酸盐缓冲液,分别作为小肠消化前期(小肠前段)和后期(小肠中后段)的缓冲液。

1.4 仿生消化系统仿生消化过程的参数设置与操作规程

通过仿生消化系统控制软件Ver 1.0(软著登字第0154149号),设置水浴锅温度为43℃,空气浴摇床温度为42℃,摇床转速为180 r/m in,蠕动泵流速为425 m L/min。模拟胃消化时长4 h,小肠消化前期和后期各时长7.5 h,残液排出时长3 m in,清洗液体积1 200 m L,清洗4次。

仿生消化操作的具体方法是:首先将1 000m L 0.05 m ol/L的KOH溶液装于清洗瓶中,运行清洗程序(清洗消化时长0.05 h,残液排出时长2 m in,清洗液用量300 m L,清洗时长2 m in,清洗1次),然后换上去离子水再将仪器管道清洗2次,最后排空管道积水,完成清洗过程。与此同时,将已处理好的透析袋洗净装于模拟消化管中,固定后一端用翻口硅胶塞密封,用去离子水冲洗透析袋内部3～4次。称取一定量的饲料样品(能量饲料约为2 g,蛋白质饲料和粗饲料约为1 g,均精确到0.000 2 g,同时另称取2份分别用于干物质含量和总燃烧热值的测定),无损失地转移至装有透析袋的模拟消化管中,再加入20m L模拟胃液(含1 550 U/m L胃蛋白酶),并用带有注射口的翻口硅胶塞密封。将模拟消化管置于仿生消化系统中,连接消化管路,点击控制软件的开始试验菜单。胃消化期完成后,仪器自动暂停,用移液器在每个模拟消化管的注射口准确加入2 m L模拟小肠液,继续进行小肠阶段消化。消化完毕后,取出模拟消化管,按清洗程序对仪器管道进行洗清。结束后退出程序,关闭电源。同时将透析袋中内容物用去离子水小心冲洗到已知绝干重的培养皿中,65℃烘干至无水痕后,再105℃烘干至恒重,用全自动氧弹计测定残渣的总燃烧热值。

1.5 数据处理与分析

根据单因素完全随机试验设计,用SAS 9.0的MEANS模块对基本统计量进行分析,GLM模块对数据进行方差分析,以Duncan氏法进行多重比较。结果以平均值±标准差表示。其中数据计算及统计模型如下:

总变异系数(CVtotal)=

式中:M1为饲料样品干物质重量(g);M2为残渣干物质重量(g);E1为饲料样品总燃烧热值(J);E2为残渣总燃烧热值(J);Y ij为干物质消化率或代谢能;为第i个组的均值;为样本总均值;G为组数,N为样本总数,N i为第i个组样本量;μ为总平均数,αi为组间效应,εij为随机误差。

2 结果与分析

2.1 同一套仿生消化系统不同批次间鸭饲料原料干物质消化率和代谢能的变异

由表2可知,同一测定批次的10个重复内,玉米、豆粕、棉籽粕和小麦麸干物质消化率的最大绝对偏差分别为1.03%、0.63%、0.67%和0.72%,批内变异系数分别为 0.66%、0.58%、1.18%和 0.78%;代谢能的最大绝对偏差分别为0.30、0.31、0.21和0.21 MJ/kg,批内变异系数分别为 0.89%、0.99%、1.22%和1.25%。不同测定批次间,玉米、豆粕、棉籽粕和小麦麸平均干物质消化率的最大绝对偏差分别为0.21%、0.09%、0.35%和 0.38%,批间变异系数分别为0.20%、0.11%、0.80%和0.63%;平均代谢能的最大绝对偏差分别为0.05、0.09、0.02和0.08MJ/kg,批间变异系数分别为0.29%、0.49%、0.24%和 0.70%。3个批次的10个重复测定中,玉米、豆粕、棉籽粕和小麦麸干物质消化率的总变异系数分别为0.65%、0.56%、1.37%和0.97%,代谢能的总变异系数分别为0.89%、1.05%、1.19%和1.38%。从不同测定批次干物质消化率和代谢能平均值的多重比较统计结果看,棉籽粕干物质消化率以及小麦麸干物质消化率和代谢能存在测定批次间的显著性差异(P＜0.05)。

2.2 不同套仿生消化系统间鸭饲料原料干物质消化率和代谢能的变异

由表3可知,同一仪器测定的10个重复内,玉米、豆粕、棉籽粕和小麦麸干物质消化率的最大绝对偏差分别为0.98%、0.92%、0.81%和0.86%,仪器内变异系数分别为 0.53%、0.79%、1.24%和0.93%;代谢能的最大绝对偏差分别为0.26、0.24、0.13和 0.26 M J/kg,仪器内变异系数分别为0.69%、0.92%、1.08%和1.32%。不同测定仪器间,玉米、豆粕、棉籽粕和小麦麸平均干物质消化率的最大绝对偏差分别为0.12%、0.33%、0.53%和0.21%,仪器间变异系数分别为 0.11%、0.39%、1.15%和0.36%;平均代谢能的最大绝对偏差分别为 0.06、0.11、0.07 和 0.08 MJ/kg,仪器间变异系数分别为0.31%、0.67%、0.70%和0.60%。3套仪器的10个重复测定中,玉米、豆粕、棉籽粕和小麦麸干物质消化率的总变异系数分别为0.51%、0.84%、1.64%和0.95%,代谢能的总变异系数分别为0.73%、1.10%、1.24%和1.39%。从不同测定仪器干物质消化率和代谢能平均值的多重比较统计结果看,豆粕与棉籽粕的干物质消化率和代谢能存在测定仪器间的显著性差异(P＜0.05)。

2.3 仿生消化系统测定不同鸭饲料原料的精密度

通过对每种鸭饲料原料的48～49个干物质消化率有效测定数据进行正态性检验,结果表明,4种饲料原料干物质消化率测定值均服从正态分布(P＞0.05,表4),玉米、豆粕、棉籽粕和小麦麸的干物质消化率分别为(76.66±0.48)%、(61.51±0.51)%、(32.69±0.52)%和(43.28±0.45)%。根据正态分布95%置信区间的确定原则,以测定平均值±1.96×标准差为95%置信区间,从而得出仿生消化系统测定玉米、豆粕、棉籽粕和小麦麸干物质消化率的重复间最大绝对偏差分别控制在0.94%、1.00%、1.02%和0.88%以内,其中85%的观测数据最大绝对偏差均不高于0.75%。

通过对每种鸭饲料原料43～50个代谢能有效测定数据进行正态性检验,结果表明,4种原料代谢能均服从正态分布(P＞0.05,表4),玉米、豆粕、棉籽粕和小麦麸的代谢能分别为(14.30±0.09)、(13.24±0.15)、(7.08±0.09)和(8.64±0.12)M J/kg。根据正态分布95%置信区间的确定原则,以测定平均值±1.96×标准差为95%置信区间,从而得出仿生消化系统测定玉米、豆粕、棉籽粕和小麦麸代谢能的重复间最大绝对偏差分别控制在 0.18、0.29、0.18 和0.24 MJ/kg,其中 85%的观测数据最大绝对偏差均不高于0.22M J/kg。

表4 仿生消化系统测定鸭饲料干物质消化率与代谢能的正态分布检验Tab le 4 Normal distribution test of d ry m atter digestibility and metabo lizab le energy of duck feedstuffs determ ined using bionic digestion system

3 讨 论

3.1 仿生消化系统测定鸭饲料原料干物质消化率与代谢能的重复性

重复性是指在重复性条件下,所获得的独立测试/测量结果间的一致程度[11],它是检验一种分析方法能否达到定量分析要求的基本指标。本试验条件下,模拟消化液的参数可完全重复,模拟消化过程全自动程控最大限度地降低了人为因素的干扰,从而保证了不同测定批次间试验条件的重复性。从重复性检验的结果看,4种常用鸭饲料原料干物质消化率及代谢能分3个批次测定的批内变异系数、批间变异系数及总变异系数都在1.40%以内,通过3套仿生消化系统测定的仪器内变异系数、仪器间变异系数及总变异系数也都在1.64%以内。这与Bourdillon等[12]报道的不同实验室间采用同一方法测定的饲料干物质含量、总能值的变异系数分别为1.27%和1.29%接近,比凯氏定氮法测定的饲料蛋白质含量的变异系数为4.39%低得多,比V aldes等[13]测定的家禽饲料的体外消化能值变异系数为8.92%和Clunies等[14]测定的饲料的干物质消化率的最大变异系数为6.98%低得多。由此可见,本仿生消化系统测定饲料的干物质消化率及代谢能的重复性上可达到类似于饲料干物质、总能、粗蛋白质分析测试的同等水平。从同一套仿生消化系统不同测定批次及不同套仿生消化系统间测试结果的变异情况看,批内变异系数与仪器内变异系数都相应地高于批间变异系数及仪器间的变异系数。这表明在分析测样中,同一样品应设置多个重复(5个重复)测定以尽量消除批内或仪器内的测试误差。从单因素方差分析结果看,部分样品(棉籽粕、小麦麸)的干物质消化率或代谢能在不同测定批次或测定仪器间存在统计显著性差异,而从数值上看,同一样品不同测定间干物质消化率与代谢能的最大偏差仅分别为0.43%和0.12 MJ/kg。这进一步说明处理内较低的变异系数导致试验处理间相对于处理内的平均变异偏高,从而导致方差分析的统计结果达到显著水平。这一现象也与Bourdillon等[12]报道的不同实验室间采用同一方法测定的饲料干物质含量、总能值及粗蛋白质含量存在显著差异的结果类似。这也表明在采用本仿生消化系统比较不同饲料原料干物质消化率或代谢能的统计分析中,除了进行常规的方差分析外,应首先需要考虑不同处理间平均值的绝对差值大于本系统测试的误差范围才视为有效显著性检验。

3.2 仿生消化系统测定鸭饲料原料代谢能的精密度与有效观测数据的取舍

精密度是指在规定条件下,所获得的独立测试/测量结果间的一致程度[11],它用来检验一种测试方法能够达到何种定量水平。本试验中,通过对每种鸭饲料原料进行43～50个干物质消化率及代谢能的重复测定得出,95%重复观测数据中玉米、豆粕、棉籽粕和小麦麸干物质消化率的最大绝对偏差分别控制在0.94%、1.00%、1.02%和0.88%以内,其中85%的观测数据最大绝对偏差均不高于0.75%;代谢能最大绝对偏差分别控制在0.18、0.29、0.18和0.24M J/kg,其中85%的观测数据最大绝对偏差均不高于0.22 MJ/kg。这一结果比排空强饲法测定鸭全价饲粮重复观测内干物质真消化率的最大绝对偏差2.05%～3.82%的精密度稍高,比排空强饲法测定的豆粕、棉籽粕等蛋白质饲料原料重复观测内代谢能的最大绝对偏差达到0.8～1.5 M J/kg有很大的提高[10,15],比现有的其他体外评定饲料养分方法也有所提高[16],同时比传统生物学法测定肉鸡饲粮表观代谢能平均值的实验室间最大偏差0.67 M J/kg的精密度也稍高[13]。这表明无论是能量饲料还是蛋白质饲料,仿生消化系统的测试精密度都可以达到生物学法定量测定饲料代谢能的定量水平。通过对4种饲料原料干物质消化率及代谢能与重复测定的标准差进行相关分析,发现两者间不存在显著相关性(r＜0.30),这表明本系统所测定的4种常用鸭饲料原料的精密度与原料的化学组成性质无关。根据上述研究结果,并结合仿生消化系统在设计功能上是一次对每一个待测样品进行5次重复测定,为了进一步规范数据的取舍原则,建议将测得的5个重复内干物质消化率与平均消化率的差值在0.75%以上,代谢能在0.22 MJ/kg以上的数据剔除。与此同时,建议将该参数作为仿生消化系统测试精密度,不同样品间比较的参考参数之一。

4 结 论

从本试验的重复性及精密度看,采用该仿生消化系统测定鸭饲料原料代谢能可以达到较高的定量水平。

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*Correspond ing au thor,p rofessor,E-m ail:zhangh f6565@vip.sina.com

(编辑 菅景颖)

A Test on Repeatability and Precision for Determ ining Metabolizable Energy of Duck Feedstuffs Using Bionic Digestion System

LIHui1,2ZHAO Feng2JI Feng1ZHANG Hongfu2*

(1.College of Animal Science and Technology,Anhui Agricultural Un iversity,Hefei230036,China;2.Sta te Key
Laboratory of Animal Nutr ition,Institute of Animal Sciences,Chinese Academy of Agricultural Science,Beijing100193,China)

The repeatability and p recision for determ ining the metabo lizab le energy of duck feedstuffs(corn,soybean meal,cottonseed meal and w heat bran)using bionic digestive system were investigated for testing w hether this system can be used for determ ination of nutrient digestibility.The single factor com pletely random ized design w as adopted for the repeatability experiments in the same and am ong the three bionic digestive systems.In each repeatability experiment,3 treatments(am ong 3 batches or 3m achines)with 10 rep licates per feedstuff were used for determ ining thein vitrod rym atter digestibility andm etabolizable energy.The results show ed that the within-batch,betw een-batch and total coefficient of variation of the drym atter digestibility and metabolizable energy of corn,soybeanmeal,cottonseed meal and w heat bran in the sam ebionic digestive system were all less than 1.40%,and the within-equipment,between-equipment and total coefficient of variation among these three bionic digestion systems were all less than 1.64%.Thenormality test and 95%confidence interval of d ry matter digestibility and metabolizable energy in 4 duck feedstu ffs showed that the maximum abso lute bias of repeatedmeasures were controlled in 0.94%,1.00%,1.02%and 0.88%in drym atter digestibility and 0.18,0.29,0.18 and 0.24MJ/kg in metabo lizab le energy of corn,soybean meal,cottonseed meal and w heat bran,respectively.In repeated determ ination,themaximum abso lute bias of 85%observed data of d ry matter digestibility and metabo lizable energy were not higher than 0.75%and 0.22 M J/kg,respectively.According to the repeatability and precision of this experiment,a relatively high quantitative level for the determ ination ofmetabo lizab le energy of duck feedstuffs can be achieved using bionic digestion system.[Chinese Journal of Animal Nutrition,2010,22(6):1709-1716]

duck feedstu ffs;m etabolizable energy;bionic digestion system;repeatability;p recision

S831

A

1006-267X(2010)06-1709-08

10.3969/j.issn.1006-267x.2010.06.035

2010-05-15

科技部创新方法工作专项(2009IM 033100);中央级科研院所基本业务费专项(2010jc-3-3)

李 辉(1985—),男,河南周口人,硕士研究生,主要从事饲料营养价值评定。E-mail:lihui2669@163.com

*通讯作者:张宏福,研究员,博士生导师,E-mail:zhanghf6565@vip.sina.com