胚胎干细胞的研究进展及临床应用*1

高佩安 张 苗 魏成芳

(1泰山医学院组织学与胚胎学教研室， 山东 泰安 271000；2泰山医学院公共卫生学院2006级医学检验本科，山东 泰安 271016；3泰山医学院附属医院妇产科，山东 泰安 271000)

胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC )是由着床前囊胚期内细胞团(inner cell mass，ICM)或早期胚胎原始生殖嵴的胚胎生殖细胞(primordial gerrn cells，PGCs)建立的、可在体外未分化状态下长期增殖传代的、具有稳定的二倍体核型、具有自我更新和多向分化增殖潜能的全能干细胞，表面特异抗原标记的、可分化为三个胚层来源的各种组织和细胞类型(包括生殖腺和生殖细胞)的永久细胞系。美国科学家James Thomo-son 和John Gearhart分别用ESC和胚胎生殖细胞建立了胚胎干细胞系，为研究ESC的发育和利用其治疗疾病提供了新的空间[1-2]。目前普遍认为，ESC对体外研究动物和人胚胎的发生发育，新基因的发现，药物的筛选和致畸实验及作为细胞组织移植治疗，克隆治疗和基因治疗的细胞源及产生克隆和转基因动物等领域将产生重要的影响。ESC成为21世纪生命科学研究领域的热点之一，现就ESC的特性以及其应用作一综述。

1 ESC的基本概念

ESC 一般是指由着床前胚泡内细胞团经体外抑制分化培养分离出来的具有多能性或全能性的细胞。ESC是由 Evans和 Kaufman[3]1981年首次从延迟植入小鼠囊胚中分离出来的多能性细胞，当时取其名字首字母而称之为 EKC,以后均改称为 ESC。

2 ESC的特性

2.1全能性 ESC具有发育的全能性(totipotencv)，即在解除分化抑制剂条件下，具有发育成为机体的不同细胞类型的任何一种和形成多种组织的能力[5]。在体外，ESC可被诱导分化出包括三个胚层在内的所有分化细胞。若将ESC注射到SCID小鼠或同源动物体内，可分化产生出三个胚层细胞组织构成的畸胎瘤。ESC也具有种系传递功能，能与另一正常胚胎嵌合，获得包括生殖系在内的动物个体。全能性是ESC具有可塑性的基础，也是ESC优于成年组织干细胞的重要特点。

2.2体外分化 在特定的体外培养条件下，ESC也能分化形成各种细胞系，如造血细胞、肌肉细胞和神经胶质细胞等。ESC体外分化途径和机制与在体胚胎细胞不完全相同，但在分子水平上仍有许多相似之处，因而可将其作为研究各种类型体细胞决定与分化机理等发育生物学问题的新颖的实验模型[6]，与传统的整体胚胎的研究相比，体外ESC具有以下几个优点：(1)ESC在体外可分化形成各种终末细胞, 这为研究某些前体细胞的起源和特性提供了理想的实验体系；(2)体外培养能定性与定量地研究某些细胞因子，胞外基质等因素对细胞生长和分化的影响，避免和减少了整体胚胎研究中各种内源性因素干扰的复杂性；(3)在研究胚胎早期发育中某些必需基因的功能时，在体胚胎的这些基因常发生突变引起胚胎过早的在子宫中死亡，而在体外这些基因突变的ESC仍保持存活、增殖和分化的潜能，参与胚胎发育[7]，因此为研究这些基因在胚胎发育中的功能提供了基本条件。

2.3遗传稳定性 ESC在分化的过程中，可以完整地体现原有的生理特点和结构组成，即基因能够得到完全的表达,具有稳定的遗传性能，因此在骨髓移植、肌肉和皮肤等的修复等医学方面具有广阔的前景[7], 也可在体外对 ESC进行遗传操作选择，如诱导外源基因、标志基因等制作嵌合体，通常不会改变选择后的ESC本身的遗传性能，所以在理论上经遗传操作后的ESC仍能保持其扩增、发育的全能性的稳定遗传[8]，这就可以根据这种性能制备转基因动物个体或基因缺失、突变或过量表达的杂合或纯合个体，以便分析各种基因功能和基因的表达调控机制等。

2.4其他特性 ESC有正常的二倍体核型，染色质多为常染色质。光镜下人ESC小、核大、核质比高，有一个或多个核仁。电镜下观察发现人ESC为不均质的细胞，大多数细胞形成紧密的球形克隆，外围是上皮样细胞[9]。未分化的ESC表达阶段特异性胚胎抗原 (stage-specific embryonic antigens，SSEA)SSEA-3、SSEA-4和肿瘤排斥抗原(tumor rejection antigen， TRA)TRA-1-60，TRA-1-81和 TRA-2-54[10]。转录因子 Oct-3、Oct-4在未分化的 ESC中呈阳性表达，Oct-3、Oct-4是 POU同源结构域家族成员，在胚胎发育过程中起着重要作用，被认为是 ESC多能性的标志。ESC同时表达碱性磷酸酶和具有高度端粒酶活性，大多数体细胞的端粒酶活性不高，并在 50～80 代有限增殖后进入老化阶段，ESC则表达高端粒酶活性，即使培养1年，传代300代仍具有高端粒酶活性。

3 ESC的分离培养与鉴定

由于ESC具有向多种细胞分化的特性及自我复制的特性，因此其培养应保持自我复制功能，同时还要保持未分化状态。①ESC体外培养条件：由于 ESC来源于分裂增殖非常活跃的早期胚胎细胞，维持其生长代谢所需的营养要充足，所以其培养液需为高糖并含谷氨酰胺,同时加胎牛血清、2-巯基乙醇等。由于 ESC生长速度快，消耗的营养物质多，培养时需注意。为防止自发分化，传代密度应相对高，密度太小或饲养层质量太差均可使 ESC生长停滞，另外不要使培养液过度成酸性[11]。②保持 ESC的多潜能性，最大限度地抑制其分化。目前常用的分化抑制物有饲养层、条件培养基和分化抑制因子。曾秋棠等[12]表明BRL条件培养基完全可以代替重组白血病抑制因子(rLIF)。人胚胎成纤维细胞完全可以代替小鼠胚胎成纤维细胞，在培养液中含有 hLIF条件下可以支持 hESC体外长期培养[13]。有学者[11]采用无饲养层的方法进行培养，其优点能排除处理饲养层细胞时所用丝裂霉素对 ESC的毒性作用。都同功等[14]运用 KNOCKOUT SR和 KNOCKOUT DMEM培养液分别代替 FBS和 DMEM，不仅在有饲养层上，而且在加上 LIF的无饲养层来培养 ESC均能保持 ESC呈未分化状态。③ESC的鉴定：形态鉴定。体外培养细胞呈小集落、贴壁生长，集落边缘清晰、光滑，细胞排列紧密，细胞间界限不清；消化后的单个ESC 小、亮、圆形，边界清，胞浆少，细胞核大，核仁明显，有 1～2个核仁，核型鉴定，正常的二倍体核型特征是 ESC全能性的基础。分化潜能检测(包括分化实验和嵌合体实验)：体外 分化实验将ESC消化离散制成悬液(1×106/ml)培养于铺有明胶的培养皿中，每 2天换 1次液 ，观察其分化结果；体内分化实验：将 ESC离散 制成悬液，以适当剂量注射到同源动物的皮下，经过一段时间即可形成混合组织瘤。手术取瘤，常规方法制成组织切片，染色并观察分化结果；嵌合体实验：通过聚合法或显微注射法，使ESC与宿主胚胎细胞共同发育并产生个体。然后通过检测 ESC在嵌合体中的表达，确定其全能性或多能性。免疫组织化学检测，比较常用的有碱性磷酸酶(AKP)和胚胎阶段特异性抗原免疫荧光标记。ESC在传代过程中始终保持胚胎干细胞性的特征，如 AKP染色阳性、干细胞转录因子OCT-4阳性表达或者高端粒酶活性等；免疫组织化学、组织化学和免疫荧光标记，以检测ESC表面标志性抗原SSEA-1，SSEA-3和 ALP等的表达情况[15]。

4 ESC的临床应用

4.1研究人胚胎发育早期疾病 人的ESC可用于研究人胚胎发育早期的一些疾病，如出生缺陷，胎盘异常引起的自发流产。也能够用来探索胚胎早期发育过程中染色体发生畸变的影响因素，这使我们能够检测儿童早期肿瘤的发生。

4.2用于癌症的治疗 癌症患者的造血功能由于化学药物治疗和放射线治疗受到严重损伤，如果完全依靠自身是难以恢复机体全部免疫功能的，而免疫功能对于癌症患者的治疗来说非常重要，从这种意义上讲，将诱导分化后的ESC移植给接受大剂量放疗和化疗的患者，有望恢复其造血和免疫功能，这为癌症的治疗带来了新的突破[16]。

4.3可以分化为神经细胞 有学者在体外将ESC诱导分化为少突胶质细胞和星形胶质细胞的前体，然后将其植入人类脱髓鞘病变模型的大鼠体内，结果显示ESC源性的前体细胞可与宿主神经元建立联系并在脊髓和大脑内形成轴突髓鞘。Lee等[17-18]报道了培养诱导ESC分化成为神经元的5步法。Lenka等[19]则发现ESC在一定的诱导条件和时间下，可分化为NSC形态的神经细胞。经免疫细胞化学和RT-PCR检测证实，该神经细胞表达巢蛋白、胶质细胞原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)。Tropel等[20]将25 μg/L 的碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)添加入达尔贝科极限必需培养液/F-l2培养液中，以诱导鼠ESC向神经细胞分化。结果在诱导7天后，通过细胞形态分析以及免疫荧光、RT-PCR和钙离子通道等检测证明，鼠ESC在一定质量浓度的bFGF和特定的培养条件下，经过诱导后能够表现出早期神经细胞的功能与特性。

4.4可以分化为心肌细胞 ESC定向分化为心肌细胞的诱导因素有：(1)化学诱导剂如维甲酸(RA)、二甲基亚砜(DMSO)和5-氮杂胞苷等在体外可诱导Es细胞向心肌细胞的定向分化。(2)细胞因子:众多细胞因子参与调控ESC向心肌谱系的提交和分化，如骨形态生成蛋白(BMP)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板源性生长因子(PDGF)和具有表皮生长因子受体样结构的Cfipto-1等。此外，胰岛素样生长因子(IGF)和促红细胞生成素(EPO)等也可诱导ESC向心肌细胞的定向分化。王治等[21]研究发现，外源性促红细胞生成素早期干预能够通过上调GATA-4、Nkx2．5mRNA的表达，促进ESC向心肌细胞的分化。(3)转录因子:在干细胞向心肌谱系的提交分化过程中，早期心肌转录因子调控着心肌特异性基因和蛋白的表达，启动干细胞的心肌终末分化。早期心肌转录因子如Nkx2.5 、Tbx5、 GATA-4 、GATA-5 、GATA-6 、Mef2c、Myocardin A和HAND等相互协同，调控心肌特异性基因和蛋白的表达，启动ESC的心肌终末分化。GATA-5、GATA-6和GATA-4一起表达于心前区中胚层，也可促进心肌细胞分化或补充GATA-4的缺失[22]。神经调节蛋白-1(NRG-1)对Nkx2．5和GATA-4的表达具有正向调节作用，能够促进ESC向心肌细胞的分化[23-24]。Tbx5初始表达于线性心管，后局限表达于心房和左心室，在心内膜与心肌发育过程中与GATA-4、GATA-6协同发挥作用[25]。Mef2c可激活心脏结构基因，参与早期心管的形成和心室肌的分化，Myocardin A是一类核蛋白，属于SAP家族，在调节心肌细胞成熟中发挥重要作用[26]。HAND可与GATA-4协同激活心肌特异性终末分化基因ANF、BNP和a-MHC等基因的表达，调控ESC向心肌细胞进行分化[27]。

4.5ESC在眼科中的应用 (1)ESC与视网膜疾病: Lamba等[28]通过实验证实ESC可被直接诱导分化为视网膜细胞及视网膜色素上皮(RPE)细胞，诱导分化的视网膜细胞移植后能整合进视网膜，并表达光感受器细胞标记。Osakada等[29]在体外成功诱导hESC高效分化为多角形RPE，同时向培养液中添加bFGF、牛磺酸和维生素A酸，产生了大量的视锥细胞和视杆细胞。此研究为治疗视网膜变性疾病，如黄斑变性或色素性视网膜炎提供了一种可能的途径。(2)ESC与角膜损伤: 人的角膜自我更新由位于角膜缘外围区域的角膜缘干细胞来维持。角膜缘干细胞的维持依靠其角膜缘微环境，包括基质中的Ⅳ 型胶原蛋白和间质中的角膜缘成纤维细胞。Homma等[30]将小鼠ESC诱导分化为角膜上皮细胞，并移植到角膜损伤小鼠身上，24 h内角膜上皮再生，表达特异性标志物，且没有形成畸胎瘤。Ahmad等[31]以Ⅳ型胶原蛋白铺板，用角膜缘成纤维细胞CM培养hESC，诱导分化为角膜和皮肤上皮样细胞。以上研究表明将ESC诱导分化为角膜上皮细胞有可能为临床角膜移植提供一种无限的供体来源。

4.6用于糖尿病的治疗 由于糖尿病的发病机制不清楚，目前仍缺乏有效的根治方法。人胚胎干细胞可定向分化为胰岛细胞，为医学界和已经丧失胰岛功能的糖尿病患者带来了新的希望[32]。

4.7用于烧伤和创伤的治疗 目前临床上对烧伤或创伤患者进行整形修复时主要是依靠自身皮肤的移植，但对于大面积严重烧伤或损伤的患者根本无法移植，只能让患者形成永久性疤痕。ESC可以诱导分化为表皮干细胞，可以移植到患者皮肤进行修复。

4.8维持基因组稳定性 DNA是细胞生命活动的重要遗传物质，保持其分子结构的完整性和稳定性对于细胞存活及正常生理功能的发挥具有重要意义。ESC可通过DNA修复机制、细胞凋亡程序或细胞分化去除受损细胞，以维持基因组稳定[33]。

4.9应用于克隆技术 新加坡国立大学生物系教授洪云汉及2名中国助手组成的研究小组，以青亘粹鱼为模式动物，成功培育出单倍体胚胎干细胞系，并将该单倍体胚胎干细胞的细胞核移植到正常的未受精卵细胞中，培育出一条名叫“霍莉”的半克隆鱼。

4.10其他用途 ESC还可以用于基因治疗和基因功能分析、新药研制和开发、肝脏等疾病的治疗、产生稀有蛋白从而研究这些蛋白质的结构和功能等方面。

随着近年来对ESC 的研究发展，人们对维持ESC未分化状态的调控机理和向特定细胞类型分化机制的认识不断深入，对ESC分化的细胞的功能特征有了更多的了解，ESC的研究为我们展示了生命科学和人类医学的美妙蓝图，但在实际操作和将来应用上尚存在许多技术难题和疑问，比如移植排斥问题，如何定向诱导干细胞的分化，以及由ESC研究引发的设计伦理、社会、法律、医学、神学和道德等争议也限制了当前ESC的发展等问题。尽管干细胞研究仍面临着一些困难，但其巨大应用价值是有目共睹的，随着基础研究的不断深入，必将在再生医学、人早期胚胎发育、治疗性药物筛选、基因治疗中有着广泛的应用前景。

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