琼脂—磷灰石仿生纳米复合材料修复兔胫骨缺损的实验研究

周 剑,张建湘*,汤 健,李全利,周 健,蔡华琼

(1安徽医科大学附属第一医院,合肥 230032；2安徽医科大学附属口腔医院；3安徽口腔疾病研究省级实验室)

自体骨移植是临床治疗骨缺损的金标准,但存在对患者的二次创伤以及取材量少的缺点,异体骨则存在着一定的免疫排斥反应以及疾病的传播。人工骨的研究为解决这个难题带来了希望[1,2]。2009年 3～10月,本研究拟用琼脂溶胶(AG)调控羟基磷灰石(HA)晶体的生长,合成新型 AG-HA纳米复合骨修复材料,通过制作兔胫骨临界性骨缺损动物模型来评价其促进骨缺损修复的效果。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康新西兰大白兔 20只,购于安徽医科大学动物实验中心,体质量 2.5～3.5 kg,雌雄不限。其中实验组 16只,术后 2、4、8、12周各 4只,4只为空白对照组。实验过程中对动物的处置参照国家科学技术部 2006年发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 试剂 溶液沉淀合成、非烧结 HA粉末(微米级,四川大学口腔医学院材料研究室提供)；AG(基因科技(上海)有限公司)；其他试剂为分析纯试剂。

1.3 复合材料的合成 将一定量的非纳米 HA的盐酸溶液,加入一定量的 AG中,调整反应体系的pH值为 7～8,然后将反应形成的复合物冷冻干燥后即得 AG-HA复合材料。

1.4 动物模型制备 根据文献制备兔胫骨上端腔隙性骨缺损模型[3]。3%戊巴比妥钠按 1 mg/kg行耳缘静脉注射麻醉,采用静脉静滴针术中留置静脉通道补液。待麻醉效果满意后,固定四肢,剪除双膝以下小腿的兔毛,碘伏消毒,铺洞巾,以膝关节以下胫骨内髁的平台为基点,做一约 3 cm纵行切口。分离软组织,仔细剪除内髁平台周围骨膜,用口腔科磨钻切除胫骨内髁的平台关节面以近皮质骨约 1.5 cm×0.8 cm大小,刮匙刮除骨髓及松质骨,冲洗后仔细止血。实验组填塞实验材料,压紧填实,对照组未处理。全层缝合皮肤,外用手术切口敷料包裹切口。术中采用静脉通道补液 250 ml,配80万 U青霉素钠,术后第 3天静脉补液 250 ml,配 40万 U青霉素钠,术后未予以固定,笼养,常规饲养。

1.5 观察指标 主要观察指标:①X线检查:于术后 2、4、8、12周处死动物后取双下肢拍片,观察骨缺损愈合情况、骨痂密度等。摄片条件为 0.4 s,50 mA,40 kV。②病理切片:取下来的骨缺损样本,甲醛固定后,甲酸常规脱钙石蜡包埋,苏木精—伊红(HE)切片染色,Olympus光学显微镜观察观察组织形态学变化。次要观察指标:大体观察:包括术后切口愈合情况、肢体活动、骨折端与材料界面及软组织界面的情况。

2 结果

2.1 实验动物数量分析 通过改进实验条件和术后饲养水平,合理改进实验时间,家兔均成活至实验要求时间。纳入实验动物 20只,进入结果分析 20只。伤口均Ⅰ期愈合,双侧观察指标均大体相同。

2.2 大体观察 实验组:术后第 2周:手术伤口生长良好,无炎性反应。处死后取材观察骨缺损表面,见植入材料表面有纤维组织膜覆盖,与周围组织界限仍然较清晰,接触较好,无炎症反应。第 4周:手术切口已经完全愈合。处死后取材见植入材料颜色较之前变淡,与周围骨组织界限已经模糊,较第 2周时与骨缺损区结合紧密,无炎症反应表现。第 8周:手术切口已正常。处死后取材见植入材料颜色较之前变淡,植入物材料的硬度与周围骨组织的硬度已接近,缺损周围有大量骨痂生成,大体观察骨缺损已明显减小。第 12周:处死后取材见骨缺损区已骨性愈合,未见纤维组织长入,有血管孔生成。空白对照组:第 12周:软组织增生充填覆盖骨缺损,未形成骨性愈合。标本剖面见骨缺损髓腔形成空腔,髓腔两端封闭,未有新生骨长入。

2.3 X线检查 实验组:术后第 2周:骨缺损区密度轻度增高,但仍较清楚。骨折断端周围有毛玻璃样骨组织形成。第 4周:骨缺损面积减少,骨痂密度增高,呈云雾状,骨痂基本能将缺损处充填,骨缺损区基本上已模糊。第 8周:骨缺损区密度较之前明显增高,骨折周围界限模糊。第 12周:缺损区已经基本愈合,密度稍降低,骨缺损边界已看不清。空白对照组:第 12周:缺损区边界硬化,境界清晰,缺损区密度不均匀。

2.4 组织学观察 实验组:术后第2周:HE切片见大量的骨髓基质细胞形成,无明显的炎症反应。成骨活跃,新生骨基质周围包绕着大量成骨细胞,可见片状、条索状、网状的新生骨基质。第 4周:新骨形成明显增多。大量的网状编织骨形成,钙化比第 2周明显较强,大量的成骨细胞包埋在骨陷窝中成为骨细胞。膜性成骨及软骨内成骨均可见。新形成的骨开始早期塑形改变,可见破骨细胞。第 8周:编织样骨组织进一步成熟,骨小梁趋于有序性,纤维的排列方向表现出负荷的适应性改建。第 12周:新生骨组织进一步成熟,表现为松质骨逐渐向密质骨的改建,出现板层骨结构,可见小血管,骨创边缘与原有正常骨组织相接,表现成骨的连续性。空白对照组:第 12周:髓腔无明显成骨现象,大量纤维组织及炎症细胞浸润,骨折断端未愈合。

3 讨论

本实验从大体观察、X线片摄片、组织学 3个方面评价了新型骨修复材料的骨修复效果。大体观察此种硬组织修复材料的标本在各个时间点均具有良好的成骨效果,骨痂形成,表面硬化,12周时表面已形成骨连接,并见骨的滋养血管长入。而对照组 12周时表面有纤维组织覆盖,剖面图见骨髓腔硬化封闭形成空腔,未有新骨形成。X线片证明,实验组每个时间点都有骨痂形成,骨缺损区形成毛玻璃样模糊影,且随着时间的推移,骨缺损区的边界越模糊,到 12周时已经不能看到缺损,符合大体观察标本所看到的情况。而对照组骨缺损区 12周时周围骨皮质硬化,缺损清晰,表明未有新生骨形成,骨缺损未得到有效修复。组织学观察术后不同时期染色切片,随着骨修复的进程,实验组材料含无机材料较多,制片过程中在甲酸的作用下已经溶解,周围有新鲜骨小梁形成,12周时骨小梁重建排列有序,板状骨形成,而对照组断端有大量纤维结缔组织及炎性细胞浸润,骨折断端封闭,新骨形成少,未形成骨性连接。

本研究通过以上 3个方面,表明 AG-HA复合材料可以促进骨缺损的修复。其可能的机理如下:实验材料是通过 AG与 HA的复合,在碱性条件下,HA晶体在 AG的调控下重新生长,获得的新型有机—无机纳米复合物。AG是一种多糖且亲水的胶体,加热使其部分醛的结构被氧化,形成羧基,其中的硫酸根、以及形成的羧基,可以与溶液中的 Ca2+发生键合反应,在过饱和的钙磷溶液中,介导 AG的成核、生长。可以作为 HA晶体生长的模板,类似骨组织中胶原蛋白等调控 HA晶体的生长。同时取代物的类型、数量、位置将会严重影响到 AG的物理性质和功能[4]。由于 HA的引入,这种连接点区域可能被破坏,使凝胶形成了相对较弱的网状结构。这导致反应结束,温度降至室温后,复合物胶凝强度降低。另外,p H通过影响多糖分子间氢键形成也导致琼脂凝胶性的破坏[5],使纳米 HA晶体能分布均匀,复合物的强度和结构发生改变。纳米的 HA晶体与天然的 HA结构类似[6,7],为纳米级的、低结晶的含碳酸根的 HA晶体,晶粒发育不完善。HA作为人体骨骼最理想的替代材料,其晶粒越细,生物活性越高。通过扫描电镜和透射电镜可观察到 AG-HA复合物上有大量纳米级 HA晶体,具有疏松多孔的结构,这种结构非常有利于细胞的黏附和生长。在与骨基质细胞共培养中也显示了良好的细胞相容性。

[1]Kong L,Ao Q,Wang A,et al.Preparation and characterization of a multilayer biomimetic scaffold for bone tissue engineering[J].JBiomater Appl,2007,22(3):223-239.

[2]Waked W,Grauer J.Silicates and bone fusion[J].Orthopedics,2008,31(6):591-597.

[3]李冀,王志强,原林,等.腔隙性骨缺损实验动物模型的建立[J].中国临床康复,2005,9(10):80-82.

[4]Y.Freile-Pelegrin,T.Madera-Santana,D.Robledo,et al.Degradation of agar films in a humid tropical climate:Thermal,mechanical,morphological and structural changes[J].Polymer Degradation and Stability,2007,92(2):244-252.

[5]马云,杨玉玲,杨震,等.琼脂凝胶质构特性的研究[J].食品与发酵工业,2007,33(9):24-27.

[6]叶成红,奚廷斐.纳米技术在医用材料领域中的应用[J].中国组织工程研究与临床康复,2008,12(45):8897-8900.

[7]李志宏,武继民,李瑞欣,等.纳米羟基磷灰石及其复合材料的研究进展[J].医疗卫生装备,2007,28(04):30-31.