DKK1在胃癌患者癌组织及血清中的表达及临床意义

张小刚,钟 理*,刘 青,王建飞,王 皓,葛 昆,秦向东

(1河北大学,河北保定 071002；2保定市第三医院)

分泌型蛋白 Dickkopf-1(DKK1)是 Wnt信号通路中重要的调节因子。研究发现,其在肺癌、食管鳞癌、肝癌中表达量明显升高,在结直肠癌中则明显下降。2007年 3月 ～2009年 6月,我们观察了胃癌患者癌组织及血清中 DKK1的表达情况,旨在探讨DKK1在胃癌诊断中的价值。

1 材料与方法

1.1 材料 选择河北大学附属医院手术切除胃癌标本 25份,患者均为男性；年龄 49～76岁,中位年龄 63.5岁。术前未接受放、化疗。另选 15份胃癌患者的癌旁组织(距离组织 ＞1 cm),患者均为男性；年龄 54～72岁,中位年龄 63.5岁。选择保定市肿瘤医院和河北大学附属医院制备的胃癌患者血清34份 ,患者男 23例,女 11例；年龄 28～87岁 ,中位年龄 65岁；抽血前均未经过手术切除和放、化疗,另选健康人血清 38例,男 25例,女 13例；年龄 22～75岁,中位年龄 62.5岁。

1.2 组织 DKK1表达检测

1.2.1 DKK1 mRNA表达检测 采用 RT-PCR法:组织标本获得后立即置于 RNA Later试剂中,-20℃保存备用。Trizol法分别提取 25份癌组织及 15份癌旁组织的总 RNA,以 Oligo(d T)15和反转录酶M-MLV对其进行反转录获得 cDNA,所有样本按照相同步骤操作。设计合成 PCR反应引物,ACTB基因为内参。PCR反应体系为 25μl,其中包含 cDNA模板 1μl,上下游引物各 1μl,Taq DNA聚合酶 1 U。PCR条件为 95℃ 15 min,94℃ 45 s,55℃ 45 s,72℃ 1 min,72℃延伸 10 min。DKK1基因扩增 35个循环,ACTB基因扩增 24个循环。扩增产物 2%琼脂糖凝胶电泳,EB染色,凝胶成像系统照相后用Quantity One软件进行图像扫描获得条带光密度值。DKK1基因与 ACTB基因条带光密度值比值为DKK1 mRNA表达量,进行半定量分析。

1.2.2 DKK1蛋白检测 采用 Western blot法:用RIPA裂解液抽提 17份胃癌及 15份癌旁组织总蛋白(另外 8份胃癌组织在进行 DKK1 mRNA表达水平检测时用完),变性后进行 SDS-PAGE电泳(5%浓缩胶,10%分离胶),将条带电转到 NC膜。膜经含 5%脱脂奶粉的 0.05%TBST室温封闭 2 h后与一抗(兔抗人 DKK1抗体和兔抗人 ACTB抗体)4℃反应过夜,经 TBST洗涤 4次(每次 5 min)后与辣根过氧化物酶(HRP)标记抗兔抗体室温反应 1 h,再经 TBST洗涤 5次(每次 5 min)后用 ECL增强型发光底物进行显色,暗室曝光 X光片,显影定影,光片扫描后用 Quantity One软件分析获得条带光密度值,DKK1蛋白与 ACTB蛋白条带光密度值比值为DKK1蛋白表达量。

1.3 血清 DKK1检测 采用 ELISA法。ELISA检测系统为 R＆D公司的 DY1906试剂盒,按说明书要求操作。鼠抗人 DKK1抗体浓度 4.0μg/ml包被 96孔板,4℃过夜,1%BSA室温封闭1 h。34份胃癌和38份健康人血清样本加样前均进行 3倍稀释,每个样品做复孔,体系 100μl,同时用标准品 DKK1蛋白做倍比稀释构建标准曲线,每个标准品做复孔,室温反应 2 h。再加入生物素标记的羊抗人 DKK1抗体50 ng/ml室温反应 2 h后用 1∶200稀释的亲合素标记的 HRP室温避光反应 20 min。TMB室温避光显色 20 min,终止反应后酶标仪读取各孔双波长 450 nm处 OD值。所得数据绘制 ROC曲线确定 DKK1的阈值。

1.4 统计学方法 采用 SPSS 16.0统计软件,所得数据用±s表示,组间差异用 Mann-Whitney U检验进行分析,检验水准 α=0.05。

2 结果

2.1 组织 DKK1表达 癌旁组织中 DKK1 mRNA与蛋白表达水平分别为(0.309 6±0.143 7)和(0.620 1±0.273 4)。与癌旁组织相比,24%(6/25)的胃癌组织 DKK1 mRNA表达上调,4%(1/25)的胃癌组织中 DKK1 mRNA表达下降,P均 ＜0.05,72%胃癌组织 DKK1 mRNA表达与癌旁组织无显著差异；5.88%(1/17)的胃癌组织 DKK1蛋白表达上调,11.76%(2/17)的胃癌组织中 DKK1蛋白表达下降,P均 ＜0.05,82.36%胃癌组织 DKK1蛋白表达与癌旁组织无显著差异。

2.2 血清 DKK1蛋白水平 胃癌及健康人血清中DKK1蛋白含量分别为(4.471±0.763 0)、(5.015±0.240 6)μg/L,P＜0.01；当确定 DKK1水平阈值为 3.539 0μg/L时,有 61.8%的胃癌患者血清DKK1含量低于此值,15.8%的正常人血清含量低于此值,其诊断敏感性为 61.8%,特异性为 84.2%。

3 讨论

研究发现,DKK1在多种肿瘤中表达异常,但胃癌中结论尚不一致。本结果显示,与癌旁组织相比,部分胃癌组织中 DKK1 mRNA和蛋白表达下降,部分胃癌组织中表达上调。分析胃癌 DKK1表达下降可能与 DKK1基因在胃癌中甲基化有关。基因启动子区域甲基化会影响基因表达。Sato等[1]发现,DKK1基因在胃肿瘤细胞株和组织中广泛存在甲基化现象；Maehata等用 DNA去甲基化试剂处理胃癌肿瘤细胞株后,DKK1基因的表达量恢复至正常水平,此为这一解释提供了依据。DKK1表达上调的原因可能为 Wnt通路本身通过 β-catenin诱导DKK1表达对其自身进行负反馈调节；野生型p53[2]、糖皮质激素[3]、孕激素[4]、DNA损伤[5]等均诱导 DKK1异常表达,具体原因还需更进一步研究。

本研究还发现,胃癌患者血清中 DKK1含量明显低于健康人,此与组织中的研究结果不完全一致。原因为组织研究中以癌旁组织为对照组,而血清学检测的对照组为正常人血清；二者基因的表达情况有所不同。李静等[6]发现,STAT3基因在人胃癌及癌旁组织中表达无显著差异,但与正常胃组织相比却明显高表达(P＜0.01)；p53 mRNA在胃癌及癌旁组织中的表达均低于正常胃组织(P＜0.01)。DKK1的表达特点与此类似。同时我们猜测胃上皮分泌细胞及腺细胞的癌化可能影响了细胞的分泌功能,从而降低了癌症患者血清中 DKK1含量。我们观察到部分胃癌组织中 DKK1表达量上升,而部分胃癌组织中表达量下降,提示 DKK1与胃癌发生发展的关系可能更为复杂,其表达水平的改变可能对肿瘤组织分型、TNM分期、淋巴结和血源性转移等胃癌病理指标更加敏感,从而在不同阶段通过对经典或非经典的 Wnt信号通路的主次调节而在胃癌发生发展中发挥作用,确切解释还需要更大量分期明确的组织样本进行更深入的研究。而胃癌患者血清中 DKK1含量明显降低提示其可能作为胃癌诊断的一项血清学指标,今后我们将用更多的早期胃癌血清样品做进一步验证,以确定其在早期胃癌诊断中的价值。

分析本研究结果,胃癌患者血清 DKK1水平明显降低,DKK1有可能作为胃癌的一个新的血清学诊断指标,但需更大的样本进一步验证。

[1]Sato H,Suzuki H,Toyota M,et al.Frequent epigenetic inactivation of Dickkopf family genes in human gastrointestinal tumors[J].Carcinogenesis,2007,28(12):2459-2466.

[2]Wang J,Shou J,Chen X.Dickkopf-1,an inhibitor of the Wnt signaling pathway,is induced by p53[J].Oncogene,2000,19(14):1843-1848.

[3]Ohnaka K,Taniguchi H,Kawate H,et al.Glucocorticoid enhances the expression of dickkopf-1 in human osteoblasts:novel mechanism of glucocorticoid-induced osteoporosis[J].Biochem Biophys Res Commun,2004,318(1):259-264.

[4]Wang FS,Ko JY,Lin CL,et al.Knocking down Dickkopf-1 alleviates estrogen deficiency induction of bone loss.A histomorphological study in ovariectomized rats[J].Bone,2007,40(2):485-492.

[5]Shou J,Ali-Osman F,Multani AS,et al.Human Dkk1,a gene encoding a Wnt antagonist,responds to DNA damage and its overexpression sensitizes brain tumor cells to apoptosis following alkylation damage of DNA[J].Oncogene,2002,21(6):878-889.

[6]李静,朴云峰,安鼎伟,等.STAT3及相关生长调控基因在胃癌组织中的表达及意义[J].中国老年学杂志,2008,28(3):269-271.