转基因植物疫苗的研究进展

郭应琳

（四川省西昌市畜牧局，四川 西昌 615000）

1 转基因植物疫苗的作用机理

转基因植物疫苗是指把植物基因工程技术与机体免疫机理相结合，生产出的能使机体获得特异抗病能力的疫苗。由于口服疫苗到肠内黏膜诱导部位之前要经过胃内的不利环境，因此有效的口服疫苗经过这些不利环境时必须要受到保护，否则会失去免疫性。而植物细胞壁作为天然的生物胶囊，可使细胞内的疫苗抵抗消化道的酸性环境和各种酶类降解，使表达的疫苗在小肠内释放，引起消化道的黏膜免疫反应，刺激黏膜下B、T淋巴细胞产生的抗菌素到消化道、血液、呼吸道中，发挥对机体的全面保护作用，疫苗通过胃进入与淋巴组织相关连的肠道，从而刺激免疫球蛋白A1的产生，以达到防治疾病的目的。动物实验已经证实，转基因植物表达的抗原蛋白经纯化后仍保留了免疫学活性，注入动物体后能产生特异性抗体；用转基因植物组织饲喂动物，转基因植物表达的抗原呈递到动物的肠道淋巴相关组织（GALT），被其表面特异受体特别是M细胞所识别，产生黏膜和体液免疫反应。

2 转基因植物疫苗的生产方法

在目前的转基因植物疫苗生产领域里，存在着两种不同的疫苗表达系统。

2.1 稳定整合的表达系统 这一方法是将抗原基因构建在植物表达载体上，利用脓杆菌或基因枪介导的方法，将抗原基因转化到植物细胞中并与植物基因组整合，获得稳定表达的转基因植株。本方法具有以下优点：一是通过有性或无性繁殖的方法，可以很容易地获得大量的转基因植株；二是通过有性杂交的方法，可以获得生产多价复合疫苗的转基因植物；三是通过特异性表达启动子使抗原基因在器官或组织中特异性表达。

2.2 瞬时表达系统 本方法是应用植物病毒作为载体，将目的基因插入病毒基因组中，然后将重组病毒接种到植物叶片上，任其蔓延，外源基因随病毒的复制而高效表达。这一方法又分为两种方式：一种是将抗原基因置于病毒基因组启动子控制之下，另一种是将抗原基因与病毒外壳蛋白基因融合在一起。值得指出的是，抗原基因融合于病毒外壳蛋白的表达方式更具有免疫原性。目前用作载体的植物病毒主要是烟草花叶病毒（TMV）和豇豆花叶病毒（CMPV）。

本方法表达量高，而且一般认为植物病毒不会传染动物，无交叉感染，但缺点是不能稳定遗传。此外，尚有几个问题需要解决：一是抗原的纯化；二是弱毒株系的选择，即病毒对植物的浸染不会使植物生长异常，还要保证抗原基因的整合不会使病毒失去浸染和复制的能力；三是现有植物病毒载体浸染的植物宿主范围有限。

2.3 生产转基因植物疫苗的一般程序 （1）克隆特异中和抗原的编码基因；（2）构建植物表达载体，把基因整合到植物表达载体上，或利用重组病毒作为载体；（3）利用各种转基因方法将抗原基因转入植物体，使植物带有编码抗原的基因；（4）进行愈伤组织的诱导和分化及转基因植物的再生，使抗原蛋白基因在植物中表达；（5）进行表达水平的检测和免疫原性的测定；（6）进行安全性评价、检测。

3 转基因植物疫苗的发展历程

近年来的研究集中在转基因植物疫苗在人类及动物中的应用。到目前为止，已报道的转基因植物疫苗大致可分为4类：即细菌疫苗、病毒疫苗、寄生虫疫苗及避孕疫苗。

3.1 细菌疫苗 用转基因植物生产的细菌疫苗主要有大肠杆菌不耐热毒素B亚单位疫苗（LT-B）和霍乱肠毒素B亚单位疫苗（CT-B）。

3.1.1 LT-B疫苗 Mason等把编码LT-B的基因转化到马铃薯中，使得LT-B在马铃薯的叶片和块茎中得到表达。经分析表明，马铃薯来源的重组LT-B具有五聚体结构，能结合神经节苷脂。

动物实验表明，转基因马铃薯产生的LT-B能刺激小鼠产生体液和黏膜免疫反应，它诱导产生的抗体能中和LT的活性。之后，他们对此进行了深入研究，结果表明LT-B主要积累在叶片和块茎中。用含有重组LT-B的马铃薯块茎直接饲喂小鼠，每周1次，每次5g（约含 LT-B 20μg），共免疫 3次，免疫后的小鼠产生了黏膜和血清抗体；同时，用5μg细菌来源的重组LT-B来免疫小鼠（采用管饲法），在第3次免疫结束后隔一周采血检测抗体水平，结果显示用马铃薯来源的重组LT-B免疫小鼠所产生的抗LT-B血清抗体和黏膜抗体水平比用细菌来源的重组LT-B免疫小鼠所产生的抗体水平高；然后用25μg的LT喂小鼠进行攻击感染，结果显示用高剂量转基因马铃薯LT-B疫苗比用源于细菌的重组LT-B疫苗更具保护作用。

3.1.2 CT-B疫苗 霍乱毒素B亚单位（CT-B）与肠道黏膜细胞表面的特异性神经节苷脂结合会引起腹泻。Arakawa等将该基因导入马铃薯中，用其块茎直接饲喂小鼠，而后在其血清和肠道内检测到了特异性抗体，当黏膜抗体水平下降后，用其块茎强化免疫，抗体水平又迅速提高。毒性中和实验表明，马铃薯口服疫苗诱导小鼠产生的特异性抗体可以中和CT的毒性。用CT接种经转基因马铃薯口服免疫后的小鼠，其肠道腹泻分泌液量与对照组小鼠相比减少了60%。以上结果说明，口服转基因植物疫苗有可能成为一种预防细菌内毒素疾病的有效手段。

3.2 病毒疫苗

3.2.1 乙型肝炎（HB）疫苗 Mason等首次报道了转基因植物HB疫苗的研究结果。乙型肝炎表面抗原（HBsAg）可刺激机体产生针对HBV的保护性抗体，此抗体是现有商业疫苗的主要成分。他们将编码HBsAg的结构基因导入烟草并获得了表达，在叶片提取液中检测到了HBsAg及其特异性mRNA，并在电镜下观察到重组HBsAg形成了直径为22nm的球形颗粒，与其天然状态相似。用相当于商用疫苗3%有效剂量的转基因植物蛋白粗提液肌肉注射小鼠，发现能诱导较强抗体。来源于经植物疫苗免疫过的小鼠T细胞，在体外能被植物来源的重组HBsAg、酵母来源的HBsAg及合成的多肽激活，表明植物疫苗免疫的小鼠产生了T细胞免疫。这些结果说明，转基因植物中表达的HBsAg具有正确的B细胞及T细胞识别表位。

刘玉乐等将人乙型肝炎病毒（adw亚型）表面抗原（HBsAg）基因插入植物双元载体pROKⅡ-HBsAg的CaMV35S启动子下游，构建重组质粒pROKⅡ-HBsAg，将此质粒导入脓杆菌LBA4404中，利用脓杆菌感染叶盘的方法转化烟草，经酶联免疫分析，发现转化植株及其后代均能产生具有免疫活性的HBsAg；免疫吸附电镜观察表明，转化植株产生的HBsAg呈典型的直径为22nm的颗粒，显示了用植物生产HBsAg的可行性。刘德虎等人利用所获得的转基因马铃薯饲喂小鼠后，在小鼠血液中检测到了乙肝病毒保护性抗体，其抗体滴度足以对人产生保护力。

3.2.2 兔出血症病毒（RHDV）疫苗 Vp60是RHDV的主要结构蛋白。Castanon等用编码RHDV Vp60蛋白的基因转化马铃薯，该转基因马铃薯植株产生了特异的mRNA和正确的Vp60蛋白，用此植株的叶片提取物免疫兔子，在兔子体内产生了高滴度的抗Vp60特异性抗体。攻毒试验表明，所免疫兔子完全避免了兔出血症的发生。

3.2.3 口蹄疫病毒（FMDV）疫苗 Wigdorovitz等用转基因苜蓿表达了FMDV结构蛋白vp1，用此转基因苜蓿的新鲜叶片饲喂小鼠后，小鼠体内产生了特异性抗体。攻毒试验表明，经免疫的小鼠能抵抗毒性FMDV的感染。

3.3 寄生虫疫苗 疟疾是世界性的严重寄生虫病。Turpen等将编码疟原虫抗原决定簇的基因片段插入到烟草花叶病毒（TMV）外壳蛋白的编码区中，构建了植物病毒载体，然后用它感染烟草，所产生的高水平重组融合蛋白经试验证明具有抗原活性。

3.4 避孕疫苗 哺乳动物受精过程中精卵细胞的结合具有种属特异性，这种特异性的结合是由精子表面的特异性蛋白与卵细胞透明带糖蛋白通过受体配体模式进行的，透明带是卵细胞膜外的一层非细胞结构，是精子与卵细胞识别和结合的部位，透明带具有多种糖蛋白，其中ZP3充当精子受体在受精过程中起着重要作用，而从避孕的角度来说它是免疫避孕的一个靶位。Fitchen等将小鼠ZP3蛋白的一个含有13个氨基酸残基的抗原决定簇转化到烟草花叶病毒的衣壳蛋白中，利用其作载体感染植物获得了转基因植物，用此转基因植物免疫小鼠，其体内产生了抗ZP3的特异性血清，还发现透明带聚集了抗ZP3抗体，证明利用转基因植物生产避孕疫苗具有可行性。

4 转基因植物疫苗的优点

4.1 利于大规模工业化生产 利用哺乳动物细胞表达系统的优点是可与人的内环境进行相似的复制、翻译、表达，但是哺乳动物细胞培养需要牛血清，成本花费大，而植物是能够大规模也是最经济的生产蛋白质的生产系统。在转基因植物中，只要将外源基因成功转入一个植株中，就可以通过种子遗传给下一代，从而大面积种植，成本很低。其次，动物细胞培养不利于大型工业化生产，它受很多因素制约，如温度、pH值、溶解氧浓度等，这些因素会影响细胞产出蛋白的量。当然，植物中蛋白质的密码子和哺乳动物的仍有差别，但是和微生物相比，这种差异较小。

4.2 使用安全 对免疫接种动物来说，表达系统中的非目的成分对动物无害，不存在其他动物病原体污染的可能；免疫接种时，不需要注射器和针头之类的设备，不存在通过注射接种而使动物感染病原微生物的可能，同时大大减少了免疫接种时动物的应激反应。关于转基因食品安全性的争论，美国食物安全和应用营养中心已经证明了卡那霉素抗性基因植物作为食物添加剂的安全性。对环境来说，转基因植物疫苗也是绿色环保产品，无论其生产过程还是生产成品都不存在污染环境的问题。转基因植物只表达亚单位疫苗，不含致病微生物或潜在的致病微生物，对人畜安全。

4.3 免疫效果好 植物细胞中的疫苗抗原通过胃内的酸性环境时可受到细胞壁的保护，直接到达肠内黏膜诱导部位，刺激黏膜和全身免疫反应。不仅如此，转基因植物口服疫苗还可诱导消化道相关淋巴样组织（GAL T）产生分泌性IgA（sIgA)，并在病原体和宿主之间相互作用的起始部位直接诱发免疫反应，从而大大提高其免疫有效性。

4.4 植物细胞具有全能性 能够再生植株且易于成活，生长周期短，易于快速筛选出转基因阳性植株。不仅比构建动物生物反应器节省时间，而且构建植物生物反应器的技术更成熟，成功率更高。

4.5 能进行有效的翻译后加工 植物与动物一样，属真核生物，具有与之相似的翻译后加工过程，适合于动物病毒抗原的表达，病毒产物具有与之相似的免疫原性。

5 展望

转基因植物作为生物反应器生产转基因植物疫苗或其他转基因产品，为人和动物提供了一个最经济有效的生产系统，具有许多潜在优势，但这只能算是起步阶段，离实际应用还有很大一段距离，还面临着许多未知的和有待解决的难题，仍需做进一步的效力试验、稳定性试验以及免疫途径、免疫剂量等多方面的研究，关键问题是提高抗原表达水平。随着转基因技术和相应检测手段的逐步建立和优化，转基因植物疫苗在产业化生产中必将具有广阔的应用前景。

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